Co-IP

一、服務(wù)介紹

免疫共沉淀（Co-Immunoprecipitation, Co-IP）是以抗體和抗原之間的專一性作用為基礎(chǔ)的用于研究兩種蛋白質(zhì)在完整細(xì)胞內(nèi)生理性相互作用的有效方法。這種方法常用于測定兩種目標(biāo)蛋白質(zhì)是否在體內(nèi)結(jié)合；也可用于確定一種特定蛋白質(zhì)的新的作用搭檔，已成為研究蛋白質(zhì)相互作用的經(jīng)典方法。

二、免疫共沉淀實驗原理

當(dāng)細(xì)胞在非變性條件下被裂解時，完整細(xì)胞內(nèi)存在的很多蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)見的相互作用被保留下來。如果以細(xì)胞中某蛋白質(zhì)為抗原，加入相應(yīng)抗體，那么該抗體就能與抗原，以及與該抗原具有相互作用的蛋白質(zhì)之間形成免疫復(fù)合物，一起沉淀下來。經(jīng)過SDS-PAGE電泳，western blot和（或）質(zhì)譜可鑒定出與抗原相互作用的蛋白質(zhì)。

三、免疫共沉淀實驗流程

1. 用預(yù)冷的PBS洗滌細(xì)胞兩次，后一次吸干PBS；

2. 按比例加入適量預(yù)冷的RIPA 緩沖液；

3. 用預(yù)冷的細(xì)胞刮子將細(xì)胞從培養(yǎng)皿或培養(yǎng)瓶上刮下，把懸液轉(zhuǎn)到1.5EP管中，4°C，緩慢晃動（EP管插冰上，置水平搖床上）；

4. 4°C離心后，立即將上清轉(zhuǎn)移到一個新的離心管中；

5. 準(zhǔn)備Protein A agarose，用PBS 洗兩遍珠子，然后用PBS配制成50%濃度，建議減掉槍尖部分，避免在涉及瓊脂糖珠的操作中破壞瓊脂糖珠；

6. 按比例加入Protein A瓊脂糖珠（50%），4℃搖晃10min（EP管插冰上，置水平搖床上），以去除非特異性雜蛋白，降低背景；

7. 4°C離心后，將上清轉(zhuǎn)移到一個新的離心管中，去除Protein A珠子；

8.用BCA法測定蛋白濃度，測前將總蛋白至少稀釋1：10倍以上，以減少細(xì)胞裂解液中去垢劑的影響（定量，分裝后，可以在-20℃保存一個月）；

9. 用PBS將總蛋白稀釋到合適濃度；

10. 加入體積的預(yù)先稀釋的一抗；

11. 4°C緩慢搖動抗原抗體混合物過夜或室溫2h，激酶或磷酸酯酶活性分析建議用2 h室溫孵育；

12. 加入Protein A瓊脂糖珠來捕捉抗原抗體復(fù)合物，4°C緩慢搖動抗原抗體混合物過夜或室溫1h；

13.瞬時離心5s，收集瓊脂糖珠-抗原抗體復(fù)合物，去上清，用預(yù)冷的洗液（或PBS）洗3遍；

14. 將上樣樣品煮5min，以游離抗原，抗體，珠子，離心，將上清電泳，收集剩余瓊脂糖珠，上清也可以暫時凍-20℃，留待以后電泳，電泳前應(yīng)再次煮5min變性。

客戶提供：

1、新鮮的樣本材料（組織、細(xì)胞或蛋白溶液）

2、免疫沉淀的抗體（或由公司代購）及待測蛋白的相關(guān)信息

3、用于western blot的一抗

交付內(nèi)容： 

實驗報告：詳細(xì)實驗步驟、圖片等。

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