TUNEL檢測(cè)

一、服務(wù)介紹

細(xì)胞凋亡是指為維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定，由基因控制的細(xì)胞自主的有序的死亡。細(xì)胞凋亡與細(xì)胞壞死不同，細(xì)胞凋亡不是一件被動(dòng)的過程，而是主動(dòng)過程，它涉及一系列基因的激活、表達(dá)以及調(diào)控等的作用，它并不是病理?xiàng)l件下，自體損傷的一種現(xiàn)象，而是為更好地適應(yīng)生存環(huán)境而主動(dòng)爭取的一種死亡過程。細(xì)胞凋亡是細(xì)胞的一種基本生物學(xué)現(xiàn)象，在多細(xì)胞生物去除不需要的或異常的細(xì)胞中起著必要的作用。它在生物體的進(jìn)化、內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定以及多個(gè)系統(tǒng)的發(fā)育中起著重要的作用。細(xì)胞凋亡不僅是一種特殊的細(xì)胞死亡類型，而且具有重要的生物學(xué)意義及復(fù)雜的分子生物學(xué)機(jī)制。凋亡是多基因嚴(yán)格控制的過程。

二、TUNEL檢測(cè)實(shí)驗(yàn)原理

TUNEL檢測(cè)（terminal dexynucleotidyl transferase (TdT)-mediated dUTP nick end labeling，末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的dUTP 缺口末端標(biāo)記測(cè)定法），也稱DNA斷裂的原位末端標(biāo)記法。細(xì)胞凋亡中染色體DNA的斷裂是個(gè)漸進(jìn)的分階段的過程，染色體DNA在內(nèi)源性的核酸水解酶的作用下降解為50-300 kb的大片段，然后大約30%的染色體DNA在Ca²⁺和Mg²⁺依賴的核酸內(nèi)切酶作用下，在核小體單位之間被隨機(jī)切斷，形成180～200 bp核小體DNA多聚體。DNA雙鏈斷裂或只要一條鏈上出現(xiàn)缺口而產(chǎn)生的一系列DNA的3’-OH末端可在脫氧核糖核苷酸末端轉(zhuǎn)移酶（TdT）的作用下，將脫氧核糖核苷酸和熒光素、過氧化物酶、堿性磷酸化酶或生物素形成的衍生物標(biāo)記到DNA的3’-末端，再用辣根過氧化物酶標(biāo)記的鏈霉親和素與衍生物上生物素結(jié)合（每個(gè)鏈霉親和素至少可以再結(jié)合3個(gè)生物素分子），后用DAB、過氧化氫與辣根過氧化物酶發(fā)生氧化、環(huán)化反應(yīng)，形成苯乙肼聚合物而呈現(xiàn)棕褐色，終通過計(jì)數(shù)每張切片上不同視野中TUNEL陽性細(xì)胞的比例來判斷細(xì)胞凋亡發(fā)生情況。由于正常的或正在增殖的細(xì)胞沒有DNA的斷裂，因而沒有3’-OH形成，很少能夠被染色。

三、TUNEL檢測(cè)實(shí)驗(yàn)流程

1、收集處理后的細(xì)胞或石蠟切片脫蠟至水。

2、過氧化氫甲醇中浸洗，抑制內(nèi)源性過氧化氫酶。

3、用蛋白酶K室溫孵育15~30分鐘。

4、滴加TUNEL反應(yīng)混合液（即配即用，4^oC避光），孵育60分鐘，在熒光鏡下（綠色）分析結(jié)果。

5、加入轉(zhuǎn)化劑-POD，孵育20~30 min。

6、加入DAB底物溶液，孵育5~10 min。

8、中性樹膠或者甘油封片，光鏡下分析結(jié)果。