小鼠腹腔巨噬細(xì)胞分離純化

一、實(shí)驗(yàn)原理

小鼠腹腔巨噬細(xì)胞分離及純化的基本原理是巨噬細(xì)胞屬不繁殖細(xì)胞群，在條件適宜下可存活 2～3 周，難以長期生存，多做原代培養(yǎng)?？捎枚喾N方法培養(yǎng)不同來源的巨噬細(xì)胞，其中以小鼠腹腔取材法*為常用，從小鼠腹腔滲出細(xì)胞中分離及純化巨噬細(xì)胞，正常小鼠每只可收集腹腔滲出細(xì)胞約10⁶，其中巨噬細(xì)胞占30％。如果給小鼠腹腔注射某種刺激物，可使巨噬細(xì)胞滲出增加，易于分離更多的巨噬細(xì)胞。

二、實(shí)驗(yàn)材料和用品

6-8周齡健康小白鼠，普通光學(xué)顯微鏡，10ml低速離心機(jī)，解剖盤，解剖剪，10ml離心管，5ml一次性注射器，生物**柜（超凈臺(tái)），0.9% NaCl生理鹽水，DMEM培養(yǎng)基，

三、實(shí)驗(yàn)流程

1. 脫頸處死小鼠，75%乙醇浸泡5min，消毒**。

2. 后續(xù)實(shí)驗(yàn)在生物**柜中操作，使小鼠仰臥于解剖盤上。

3. 向腹腔注射生理鹽水：用注射器吸取5mL生理鹽水或細(xì)胞培養(yǎng)基，提起小鼠腹中部的皮膚和腹膜，讓針頭從提取處穿刺進(jìn)入小鼠腹腔，緩緩?fù)谱⑸睇}水或細(xì)胞培養(yǎng)基，輕揉小鼠腹部數(shù)次，靜置3-5min，使液體在腹腔內(nèi)充分流動(dòng)。

4.  解剖暴露腹膜：用鑷子提起下腹皮膚，使其與腹膜分開，在鑷子提取處將皮膚剪開一個(gè)小口，再向上、向下剪開整個(gè)腹部皮膚，雙手食指拇指分別在腹中部捏住兩側(cè)皮膚慢慢向兩邊撕開，使腹膜暴露。

5. 抽取腹腔液：用手夾住小鼠一側(cè)皮膚，中指向內(nèi)擠壓內(nèi)臟，在腹腔內(nèi)形成空腔，將注射器針頭插入縫隙處抽取腹腔液，再將腹腔液注入離心管。

6. 細(xì)胞培養(yǎng)：將收集的腹腔灌洗液在1000r/min條件下離心10min，棄去上清，PBS潤洗一遍，加入細(xì)胞培養(yǎng)基重懸并進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，調(diào)整細(xì)胞濃度后接種至細(xì)胞培養(yǎng)瓶，37℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)4-6h，待巨噬細(xì)胞充分貼壁后，棄去上清，更換新的細(xì)胞培養(yǎng)基后，放回培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。

四、注意事項(xiàng)

1. 從下腹部一側(cè)進(jìn)針注入灌洗液，以確保針眼收縮，不至于因腹腔液的增加而從針眼處出血，避免血細(xì)胞混入巨噬細(xì)胞懸液中。

2. 腹腔注射后應(yīng)輕揉腹部，既要避免滲血，又要確保巨噬細(xì)胞游離出來，然后徹底灌洗，盡可能獲得較多的巨噬細(xì)胞。如果吸出的灌洗液液呈淡黃色，則獲得的巨噬細(xì)胞較多；如果吸出的灌洗液仍為無色透明，獲得巨噬細(xì)胞則較少。分析此現(xiàn)象可能是游離出的大量巨噬細(xì)胞使其環(huán)境變?yōu)樗嵝运隆?/span>

3. 無菌條件下打開腹腔，直視吸取，可防止因吸入腸系膜或腹膜等而堵塞針眼的現(xiàn)象，并可迅速且較完全地吸出灌洗液。

4. 收集炎性腹腔巨噬細(xì)胞時(shí)，處死小鼠前先用注射器向小鼠腹腔注射 1 ml 3% 豚蛋白胨肉湯或 2 ml 無菌的液體石蠟，待 3~4 天后按上述步驟收集。

5. 暴露腹膜時(shí)注意不要將肚皮剪破。

6. 抽取腹腔液針頭不能扎到腸子或內(nèi)臟。

7. 實(shí)驗(yàn)操作時(shí)要注意無菌操作。