1、材料準(zhǔn)備

1. 新鮮的人體肌肉組織樣本；
2. 無菌手術(shù)器械，如手術(shù)刀、鑷子等；
3. 細(xì)胞解離液，可選擇適合肌肉組織的酶類解離液；
4. 無菌 PBS（磷酸鹽緩沖液）；
5. 針對(duì)衛(wèi)星細(xì)胞的特異性抗體；
6. 流式細(xì)胞儀及配套軟件；
7. 細(xì)胞過濾器；
8. 離心管；
9. 染色緩沖液；
10. 培養(yǎng)基。

2、操作步驟

2.1 樣本處理

(1)  手術(shù)室獲取的新鮮肌肉組織浸泡于含有無菌HBSS的50 mL離心管中，快速運(yùn)輸至實(shí)驗(yàn)室，運(yùn)輸過程中注意防止污染；

(2)  到達(dá)實(shí)驗(yàn)室后，在提前準(zhǔn)備好的超凈臺(tái)內(nèi)將肌肉放置于100 mm×20 mm 培養(yǎng)皿中，用無菌剪刀和鑷子去除脂肪、血管、肌腱等結(jié)締組織，留下肌肉并稱質(zhì)量，記錄標(biāo)本的質(zhì)量；

(3)  將處理好的標(biāo)本移入50 mL離心管，加入含有體積分?jǐn)?shù)10% 胎牛血清、1%青霉素/鏈霉素的DMEM培養(yǎng)液，肌肉標(biāo)本在4 ℃冰箱中可保存5-7 d；

2.2 組織解離

(1)  行多參數(shù)流式細(xì)胞分選當(dāng)天，將肌肉從4 ℃冰箱中取出，在提前準(zhǔn)備好的超凈臺(tái)內(nèi)將肌肉放置于100 mm×20 mm培養(yǎng)皿中，將保存肌肉的含有體積分?jǐn)?shù)10%胎牛血清、1%青霉素/鏈霉素的DMEM培養(yǎng)液也移入其中，用無菌剪刀和鑷子將肌組織剪碎至約1 mm3 大小，能順利通過10 mL移液管即可；

(2)  將剪碎的標(biāo)本用10 mL移液管移至50 mL離心管中，1500 r/min離心 5 min，去上清；

(3)  用10 mL移液管將每2.0-3.0 g的肌肉標(biāo)本移至30 mL消化液中(消化液由HBSS和Ⅰ型膠原酶、Ⅳ 型膠原酶、分散酶組成，酶的終質(zhì)量濃度分別為100，100，1.2 mg/L)，然后放至臺(tái)式恒溫振蕩器中，37 ℃ 60 r/min 消化1.0-2.0 h，每隔20 min取出標(biāo)本置于超凈臺(tái)中，用移液管吹打10次，并觀察消化情況。當(dāng)觀察到塊狀組織消融，消化如漿液狀即可，具體消化時(shí)間可根據(jù)消化程度進(jìn)行調(diào)整；

2.3 細(xì)胞過濾

(1)  消化完全后，加入大約10 mL含體積分?jǐn)?shù)10%胎牛血清、1%青霉素/鏈霉素的DMEM培養(yǎng)液終止消化， 1500 r/min 離心5 min，小心去上清；

(2)  將組織重懸于大約10 mL含體積分?jǐn)?shù)10%胎牛血清、1%青霉素/鏈霉素的 DMEM培養(yǎng)液中，用移液管吸取離心好的組織通過70 μm 濾過膜濾過，濾過過程中用含體積分?jǐn)?shù)10%胎牛血清、1% 青霉素/鏈霉素的DMEM培養(yǎng)液沖洗，并不停的旋轉(zhuǎn)移液管，使濾過充分；

2.4 離心收集細(xì)胞

(1)  將過濾好的組織標(biāo)本1500 r/min離心 5 min，小心去上清。將細(xì)胞重懸于1 mL紅細(xì)胞裂解液中，反復(fù)吹打混勻，室溫放置10 min；

(2)  然后1500 r/min離心 5 min，去上清，*后重懸于1 mL DPBS中，過40 μm濾膜濾過后計(jì)數(shù)(也可上機(jī)前進(jìn)行)。

2.5 抗體標(biāo)記

(1)  將單細(xì)胞懸液離心，棄去上清液。

(2)  用適量的染色緩沖液重懸細(xì)胞。

(3)  加入特異性一抗，在合適的溫度（通常為 4℃或室溫）下孵育一定時(shí)間，一般為 30 分鐘至數(shù)小時(shí)。

(4)  如果一抗不是熒光標(biāo)記的，需加入熒光標(biāo)記的二抗，再次孵育。

2.6 流式細(xì)胞儀檢測

(1)  用染色緩沖液洗滌細(xì)胞，去除未結(jié)合的抗體。

(2)  將標(biāo)記好抗體的細(xì)胞懸液調(diào)整到合適的濃度，上流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測。

(3)  根據(jù)抗體所帶的熒光標(biāo)記設(shè)置流式細(xì)胞儀的參數(shù)，如不同的熒光通道等。

2.7 數(shù)據(jù)分析

(1)  流式細(xì)胞儀軟件會(huì)生成細(xì)胞的散點(diǎn)圖和直方圖等。

(2)  根據(jù)衛(wèi)星細(xì)胞的特定標(biāo)記物的熒光信號(hào)，在圖中圈出陽性細(xì)胞群體，即可能的衛(wèi)星細(xì)胞。

(3)  分析衛(wèi)星細(xì)胞的比例、熒光強(qiáng)度等參數(shù)。

3、注意事項(xiàng)

1. 抗體的選擇要準(zhǔn)確，確保其特異性針對(duì)衛(wèi)星細(xì)胞的標(biāo)志物。
2. 嚴(yán)格控制孵育時(shí)間和溫度，以保證抗體結(jié)合的效果。
3. 流式細(xì)胞儀的操作要規(guī)范，避免出現(xiàn)誤差和污染。
4. 數(shù)據(jù)分析時(shí)要結(jié)合對(duì)照樣本，排除非特異性信號(hào)的干擾。
5. 整個(gè)操作過程應(yīng)在無菌條件下進(jìn)行，以防止污染。
6. 選擇合適的細(xì)胞解離液和解離時(shí)間，避免過度解離導(dǎo)致細(xì)胞損傷。
7. 操作要輕柔，盡量減少對(duì)細(xì)胞的機(jī)械損傷。
8. 及時(shí)進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)和活力檢測，以便評(píng)估制備效果。

4、參考文獻(xiàn)

[1]古晶晶,楊繼輝,楊婷婷,等.多參數(shù)流式細(xì)胞術(shù)分選人骨骼肌源性血管內(nèi)皮細(xì)胞和血管外膜細(xì)胞的方法[J].中國組織工程研究,2018,22(21):3357-3364.