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一、總蛋白提取
1. 材料準備
(1) 組織樣本或細胞樣本。
(2) 蛋白提取裂解液，通常含有去污劑、蛋白酶抑制劑等。
(3) 勻漿器、離心機等設(shè)備。
2. 操作步驟
2.1對于組織樣本：
將新鮮的組織切成小塊，放入預(yù)冷的勻漿器中。加入適量的蛋白提取裂解液，在冰上進行勻漿，使組織充分裂解。
2.2對于細胞樣本：
(1) 取根據(jù)分組給藥處理48h過的六孔板中的細胞，將6孔板中上清用移液器棄掉，每孔用1ml 1×PBS潤洗2次，吸凈孔中液體，用0.5毫升的胰酶消化。
(2) 終止消化后將細胞吹下來，盡量不要產(chǎn)生氣泡。將細胞轉(zhuǎn)移到EP管中，做上標記并配平后，離心機1000rpm離心5min，棄上清。
(3) 每管加入150μl細胞裂解液（100μl ripa+1μl pmsf，需提前從-20℃冰箱拿出化凍），吹打混勻。
(4) 置于冰上裂解半小時，放入-80℃冰箱，凍融3次，打開高速低溫離心機，溫度降低到4℃才可以使用，離心機14000轉(zhuǎn)離心30min（高速離心機使用時一定要配平）。
(5) 用10μl移液器小心吸取上清，即為提取的總蛋白溶液。
二、BCA定量：
(1) 首先，需要準備標準蛋白溶液。我們移液器吸取15微升的標準蛋白溶液（濃度為10mg/ml）到EP管中，然后再添加285μl的生理鹽水，從而得到濃度為0.5mg/ml的標準蛋白溶液。接著，按照表4中預(yù)先設(shè)計好的濃度梯度，配置8管不同濃度的標準蛋白溶液。
表 標準蛋白梯度濃度配制
|
蛋白濃度（mg/ml） |
0 |
0.025 |
0.05 |
0.1 |
0.2 |
0.3 |
0.4 |
0.5 |
|
生理鹽水（μl） |
80 |
76 |
72 |
64 |
48 |
32 |
16 |
0 |
|
0.5mg/ml的標準蛋白（μl） |
0 |
4 |
8 |
16 |
32 |
48 |
64 |
80 |
(2) 接下來，對蛋白樣品進行稀釋。我們?nèi)?/span>72μl的生理鹽水到EP管中，做好標記，再加入8微升的蛋白樣品，將其混勻，相當于稀釋10倍。這一步的目的是使樣品的濃度范圍與標準蛋白溶液的濃度范圍相匹配，以便后續(xù)進行比較和分析。
(3) 按照分組，每組三個復(fù)孔，每孔20微升樣品和200μl的AB液混合液。
(4) 隨后，將96孔板板蓋拿掉后放入酶標儀中，在37攝氏度條件下間隔振蕩30分鐘。這一步的目的是讓AB液與蛋白質(zhì)發(fā)生反應(yīng)，形成有色化合物，其顏色深淺與蛋白質(zhì)的濃度成正比。
(5) *后，測量每個孔的吸光度值，根據(jù)標準蛋白溶液的濃度和吸光度值繪制標準曲線，根據(jù)待測蛋白提取液的吸光度值，在標準曲線上計算出對應(yīng)的蛋白濃度。
(6) 根據(jù)BCA定量的結(jié)果調(diào)整樣品蛋白的濃度，使各組的濃度相同，用ripa作為稀釋液稀釋，再加入等同于蛋白溶液體積1/4的5×loading buffer，用渦旋混勻器混勻后，在電磁爐中水浴100℃ 15min，降到室溫后放入-80℃冰箱中保存。
