1、石蠟切片簡(jiǎn)介

石蠟切片（paraffin section） 組織學(xué)常規(guī)制片技術(shù)中*為廣泛應(yīng)用的方法。石蠟切片不僅用于觀察正常細(xì)胞組織的形態(tài)結(jié)構(gòu)，也是病理學(xué)和法醫(yī)學(xué)等學(xué)科用以研究、觀察及判斷細(xì)胞組織的形態(tài)變化的主要方法，而且也已相當(dāng)廣泛地用于其他許多學(xué)科領(lǐng)域的研究中。教學(xué)中，光鏡下觀察切片標(biāo)本多數(shù)是石蠟切片法制備的?；畹募?xì)胞或組織多為無(wú)色透明，各種組織間和細(xì)胞內(nèi)各種結(jié)構(gòu)之間均缺乏反差，在一般光鏡下不易清楚區(qū)別出；組織離開機(jī)體后很快就會(huì)死亡和產(chǎn)生組織腐敗，失去原有正常結(jié)構(gòu)，因此，組織要經(jīng)固定、石蠟包埋、切片及染色等步驟以免細(xì)胞組織死亡，而能清晰辨認(rèn)其形態(tài)結(jié)構(gòu)。

2、基本技術(shù)

1. 簡(jiǎn)單說(shuō)明

石蠟切片法包括取材、固定、洗滌和脫水、透明、浸蠟、包埋、切片與貼片、脫蠟、染色、脫水、透明、封片等步驟。一般的組織從取材固定到封片制成玻片標(biāo)本需要數(shù)日，但標(biāo)本可以長(zhǎng)期保存使用，為長(zhǎng)久性顯微玻片標(biāo)本。

2. 取材

應(yīng)根據(jù)要求選取材料來(lái)源及部位。例如植物細(xì)胞有絲分裂多選取洋蔥根尖，細(xì)胞分裂快又便于切?。回i的肝小葉邊界清晰明確；耳蝸以豚鼠的內(nèi)耳易于定位和剝離。材料必須新鮮，擱置時(shí)間過(guò)久則產(chǎn)生蛋白質(zhì)分解變性，導(dǎo)致細(xì)胞自溶及**的滋生，而不能反映組織活體時(shí)的形態(tài)結(jié)構(gòu)。

3. 固定

用適當(dāng)?shù)幕瘜W(xué)藥液——固定液浸漬切成小塊的新鮮材料，迅速凝固或沉淀細(xì)胞和組織中的物質(zhì)成分、終止細(xì)胞的一切代謝過(guò)程、防止細(xì)胞自溶或組織變化，盡可能保持其活體時(shí)的結(jié)構(gòu)。固定能使組織硬化，有利于切片的進(jìn)行，而且也有媒浸作用，有利于組織著色。固定液的種類很多，其對(duì)組織的硬化收縮程度以及組織內(nèi)蛋白質(zhì)、脂肪、糖類等物質(zhì)的作用各不相同。例如純酒精可固定肝糖而能溶解脂肪，甲醛能固定一般組織，但溶解肝糖和色素。固定液可分為單一固定液及混合固定液。前者有甲醛（乙醛、福爾馬林）、酒精、醋酸或冰醋酸、升汞、鋨酸（四氧化鋨）、重鉻酸鉀及苦味酸等，單一固定液不能固定細(xì)胞中的所有成分；混合固定液可以互補(bǔ)不足，常用的混合固定液有Bouin氏液、Zenker氏液、FAA液、Carnoy氏液、SuSa液（配方見有關(guān)技術(shù)書籍）。因此，應(yīng)根據(jù)所要顯示的內(nèi)容來(lái)選擇適宜的固定液。10%福爾馬林（4%甲醛）或10%磷酸緩沖福爾馬林是病理切片常規(guī)使用的固定液，不僅適用于常規(guī)蘇木精-伊紅（HE）染色，還可以用于組織學(xué)有關(guān)的其他技術(shù)的切片染色。固定液的用量通常為材料塊的20倍左右，固定時(shí)間則根據(jù)材料塊的大小及松密程度以及固定液的穿透速度而定，可以從1小時(shí)至數(shù)天，通常為1小時(shí)至24小時(shí)。

4. 洗滌與脫水

固定后的組織材料需除去留在組織內(nèi)的固定液及其結(jié)晶沉淀，否則會(huì)影響后期的染色效果。該步驟稱作洗滌多數(shù)用流水沖洗；使用含有苦味酸的固定液固定的則需用酒精多次浸洗；使用酒精或酒精混合液固定的組織，則不必洗滌，可直接進(jìn)行脫水。固定后或洗滌后的組織內(nèi)充滿水分，若不除去水分則無(wú)法進(jìn)行以后的透明、浸蠟與包埋處理，原因在于透明劑多數(shù)是苯類，苯類和石蠟均不能與水相溶合，水分不能脫盡，苯類無(wú)法浸入。酒精為常用脫水劑，它既能與水相混合，又能與透明劑相混。為了減少組織材料的急劇收縮，應(yīng)使用從低濃度到高濃度遞增的順序進(jìn)行，通常從30%或50%酒精開始，經(jīng)70%、85%、95%直至純酒精（無(wú)水乙醇），每次時(shí)間為1～數(shù)小時(shí)，如不能及時(shí)進(jìn)行各級(jí)脫水，材料可以放在70%酒精中保存，因高濃度酒精易使組織收縮硬化，不宜處理過(guò)久。正丁醇、叔丁醇、丙酮及二氧陸環(huán)等也可做脫水劑。

5. 透明

純酒精不能與石蠟相溶，還需用能與酒精和石蠟相溶的媒浸液，替換出組織內(nèi)的酒精。材料塊在這類媒浸液中浸漬，出現(xiàn)透明狀態(tài)，此液即稱透明劑，透明劑浸漬過(guò)程稱透明。常用的透明劑有二甲苯、苯、氯仿、正丁醇等，各種透明劑均是石蠟的溶劑。通常組織先經(jīng)純酒精和透明劑各半的混合液浸漬1～2小時(shí)，再轉(zhuǎn)入純透明劑中浸漬。透明劑的浸漬時(shí)間則要根據(jù)組織材料塊大小及屬于囊腔抑或?qū)嵸|(zhì)器官而定。如果透明時(shí)間過(guò)短，則透明不徹底，石蠟難于浸入組織；透明時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，則組織硬化變脆，就不易切出完整切片，*長(zhǎng)為數(shù)小時(shí)。

6. 浸蠟與包埋

用石蠟取代透明劑，使石蠟浸入組織而起支持作用。通常先把組織材料塊放在熔化的石蠟和二甲苯的等量混合液浸漬1～2小時(shí)，再先后移入2個(gè)熔化的石蠟液中浸漬3小時(shí)左右，浸蠟應(yīng)在高于石蠟熔點(diǎn)3℃左右的溫箱中進(jìn)行，以利石蠟浸入組織內(nèi)。浸蠟后的組織材料塊放在裝有蠟液的容器中（擺好在蠟中的位置），待蠟液表層凝固即迅速放入冷水中冷卻，即做成含有組織塊的蠟塊。容器可用光亮且厚的紙折疊成紙盒或金屬包埋框盒。如果包埋的組織塊數(shù)量多，應(yīng)進(jìn)行編號(hào)，以免差錯(cuò)。石蠟熔化后應(yīng)在蠟箱內(nèi)過(guò)濾后使用，以免因含雜質(zhì)而影響切片質(zhì)量，且可能損傷切片刀。通常石蠟采用熔點(diǎn)為56～58℃或60～62℃兩種，可根據(jù)季節(jié)及操作環(huán)境溫度來(lái)選用。

7. 切片

包埋好的蠟塊用刀片修成規(guī)整的四棱臺(tái)，以少許熱蠟液將其底部迅速貼附于小木塊上，夾在輪轉(zhuǎn)式切片機(jī)的蠟塊鉗內(nèi)，使蠟塊切面與切片刀刃平行，旋緊。切片刀的銳利與否、蠟塊硬度是否適當(dāng)都直接影響切片質(zhì)量，可用熱水或冷水等方法適當(dāng)改變蠟塊硬度。通常切片厚度為4～7微米，切出一片接一片的蠟帶，用毛筆輕托輕放在紙上。

8. 貼片與烤片

用粘附劑將展平的蠟片牢附于載玻片上，以免在以后的脫蠟、水化及染色等步驟中二者滑脫開。粘附劑是蛋白甘油。首先在潔凈的載玻片上涂抹薄層蛋白甘油，再將一定長(zhǎng)度蠟帶（連續(xù)切片）或用刀片斷開成單個(gè)蠟片于溫水（45℃左右）中展平后，撈至玻片上鋪正，或直接滴兩滴蒸餾水于載玻片上，再把蠟片放于水滴上，略加溫使蠟片鋪展，*后用濾紙吸除多余水分，將載玻片放入45℃溫箱中干燥，也可在37℃溫箱中干燥，但需適當(dāng)延長(zhǎng)時(shí)間。

9. 切片脫蠟及水化

干燥后的切片需脫蠟及水化才能在水溶性染液中進(jìn)行染色。用二甲苯脫蠟，再逐級(jí)經(jīng)純酒精及梯度酒精直至蒸餾水。如果染料配制于酒精中，則將切片移至與酒精近似濃度時(shí)，即可染色。

10. 染色

染色的目的是使細(xì)胞組織內(nèi)的不同結(jié)構(gòu)呈現(xiàn)不同的顏色以便于觀察。未經(jīng)染色的細(xì)胞組織其折光率相似，不易辨認(rèn)。經(jīng)染色可顯示細(xì)胞內(nèi)不同的細(xì)胞器及內(nèi)含物以及不同類型的細(xì)胞組織。染色劑種類繁多，應(yīng)根據(jù)觀察要求及研究?jī)?nèi)容采用不同的染色劑及染色方法，還要注意選用適宜的固定劑才能取得滿意的結(jié)果。經(jīng)典的蘇木精（Hematoxylin）和伊紅（曙紅，Eosin）染色法是組織學(xué)標(biāo)本及病理切片標(biāo)本的常規(guī)染色，簡(jiǎn)稱HE染色。經(jīng)HE染色后，細(xì)胞核被蘇木精染成紫藍(lán)色，多數(shù)細(xì)胞質(zhì)及非細(xì)胞成分被伊紅染成粉紅色。由于蘇木精是帶陽(yáng)離子的染料，染液呈堿性，核內(nèi)染色質(zhì)及胞質(zhì)內(nèi)核糖體等物質(zhì)對(duì)這種染料有親和性，稱嗜堿性；而帶陰離子的染料伊紅配制的染液呈酸性，對(duì)這種染料的親和性，稱嗜酸性。有時(shí)不同的組織結(jié)構(gòu)還需要用特殊的染料及染色方法加以顯示，稱特殊染色。有些細(xì)胞組織經(jīng)硝酸銀浸潤(rùn)后，可使溶液中銀離子還原成金屬銀或銀粒附著在細(xì)胞組織上，呈棕黑色，這種性質(zhì)稱親銀性，而有些細(xì)胞組織本身不能使硝酸銀的銀離子還原成金屬銀，還需加還原劑才能將銀離子還原，稱嗜銀性。

11. 切片脫水、透明和封片

染色后的切片尚不能在顯微鏡下觀察，需經(jīng)梯度酒精脫水，在95%及純酒精中的時(shí)間可適當(dāng)加長(zhǎng)以保證脫水徹底；如染液為酒精配制，則應(yīng)縮短在酒精中的時(shí)間，以免脫色。二甲苯透明后，迅速擦去材料周圍多余液體，滴加適量（1～2滴）中性樹膠，再將潔凈蓋玻片傾斜放下，以免出現(xiàn)氣泡，封片后即制成長(zhǎng)久性玻片標(biāo)本，在光鏡下可長(zhǎng)期反復(fù)觀察。注意有些染料需特定廠家生產(chǎn)的產(chǎn)品。根據(jù)各種染色方法、組織類別及切片厚度，掌握適宜的染色時(shí)間，才能達(dá)到較好的染色效果。

3、技術(shù)結(jié)合

石蠟包埋組織流式細(xì)胞儀DNA含量分析 是石蠟包埋組織切片與流式細(xì)胞術(shù)（flow cytometry，FCM）結(jié)合使用來(lái)測(cè)量DNA含量及倍體分析，這一結(jié)合是流式細(xì)胞儀在臨床應(yīng)用中，特別是在腫瘤研究方面開拓了新的研究途徑。FCM是激光、電子和電子計(jì)算機(jī)、流體噴射技術(shù)的綜合發(fā)展應(yīng)用，是快速定量分析細(xì)胞的技術(shù)，要求被檢細(xì)胞呈懸浮狀態(tài)。已可測(cè)量細(xì)胞的大小、體積、DNA含量、DNA合成速率、RNA含量、表面抗原、染色體等。由于制備樣品技術(shù)的原因，過(guò)去許多流式分析資料**于采用新鮮組織標(biāo)本，Hedley等1983年首先報(bào)導(dǎo)了FCM分析石蠟包埋組織切片制備分散細(xì)胞懸液技術(shù)來(lái)進(jìn)行DNA含量的檢測(cè)，從組織切片中能獲得足夠數(shù)量的單個(gè)細(xì)胞，且與新鮮組織分離獲得的單個(gè)細(xì)胞在形態(tài)及DNA含量組方圖上均極為相似。國(guó)內(nèi)也在逐步開展這方面的研究。由于這種方法取材可在病理組織觀察或診斷基礎(chǔ)上進(jìn)行，比活檢或手術(shù)切除標(biāo)本更為準(zhǔn)確，又可做回顧性研究分析；且對(duì)DNA檢測(cè)速度快、數(shù)據(jù)客觀可靠，在腫瘤診斷、預(yù)后的預(yù)測(cè)和**反應(yīng)上具有重要價(jià)值；利用過(guò)去的標(biāo)本可成批制作細(xì)胞懸液、成批上機(jī)測(cè)試，避免了儀器調(diào)試狀態(tài)不同帶來(lái)的影響，石蠟包埋塊保存時(shí)間的長(zhǎng)短對(duì)結(jié)果影響不大。

常規(guī)固定（多數(shù)用福爾馬林）、石蠟包埋的組織塊均可用于流式細(xì)胞術(shù)，但含苦味酸或汞的固定液均不宜使用。切片厚度以30～50微米為宜。切片脫蠟要干凈、徹底，否則制備出的細(xì)胞懸液中碎片多，影響測(cè)定。梯度酒精水化后用胃蛋白酶或胰蛋白酶消化，消化后鏡檢呈單個(gè)分散狀態(tài)；由于福爾馬林固定可使DNA和核蛋白產(chǎn)生共價(jià)交聯(lián)，影響DNA和染料的化學(xué)定量結(jié)合，導(dǎo)致熒光強(qiáng)度下降，蛋白酶可破壞其聯(lián)結(jié)，改善測(cè)定的組方圖質(zhì)量，消化時(shí)間以能分散細(xì)胞及細(xì)胞碎片盡量少為適度，以100目尼龍篩網(wǎng)濾去未消化完的組織片，離心去上清液后，加入冰冷的70%酒精固定，放入4℃冰箱備用。上機(jī)前染色。DNA特異熒光染料主要有：（1）碘化丙錠（PI）；（2）溴化乙錠（EB）；（3） 4，6-二脒基-二苯基吲哚（DAPI）。FCM檢測(cè)石蠟包埋組織細(xì)胞DNA含量可做為以形態(tài)學(xué)為基礎(chǔ)，多參數(shù)綜合診斷中的一個(gè)重要的新手段。由于儀器設(shè)備價(jià)格昂貴及制備樣品的諸多環(huán)節(jié)均可能影響測(cè)定的數(shù)據(jù)，限制了臨床的廣泛使用。

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