一、實驗原理

蛋白免疫印跡（ Western Blot，WB）是將蛋白樣本通過聚丙烯酰胺電泳按分子量大小分離，再轉(zhuǎn)移到雜交膜（blot）上，然后通過一抗/二抗復(fù)合物對靶蛋白進行特異性檢測的方法。 WB 是進行蛋白質(zhì)分析*流行和成熟的技術(shù)之一。

二、實驗步驟

1. 制膠：用去離子水將玻璃板沖洗干凈，晾干后裝配到夾板上。用超純水檢漏，確定不漏后棄去板縫中的超純水，用濾紙吸干。根據(jù)實驗要求，按照配方配制10%的分離膠，配置過程中需注意AP*后加，并且要快速地混勻；混勻后用移液器沿著板縫邊緣緩緩加入7ml分離膠，盡量不要產(chǎn)生氣泡，加完后，沿板縫上方來回移動緩慢加入1ml異丙醇。靜置25分鐘左右分離膠就會凝固。將異丙醇倒掉，用濾紙吸附殘余的異丙醇。將1.5mm、10孔規(guī)格的梳子用純水洗干凈，插入板縫中間。按照配方配置5%的濃縮膠，混勻后用移液器抵著梳子和玻璃板邊緣之間的縫隙加入，移液器中液體不要打完，避免產(chǎn)生氣泡。加滿后室溫靜置至完全凝固（25min左右）。

1. 上樣：將蛋白樣品、Marker以及1×loading buffer取出置于冰上化凍，因為蛋白質(zhì)容易降解，所以必須要放到冰上化凍。將制好的膠放入電泳槽中，量取30ml的10×電泳液用純水稀釋到300ml，得到1×電泳液，在板中間加電泳液，直到溢出到槽中。拔掉梳子，按照順序?qū)悠沸⌒亩志徛丶尤氲侥z孔內(nèi)，剩下的孔用1×loading buffer補齊，防止樣品飄逸。
2. 電泳：將電泳盒的蓋子蓋好，注意電極的正負，設(shè)置恒壓80v，開始后電泳盒中有小氣泡產(chǎn)生，則說明有電流回路。大約四五十分鐘后，觀察Marker的位置，若Marker已完全分開，則將電壓改為恒壓120v，繼續(xù)電泳直至loading跑至分離膠底部時關(guān)閉電泳儀。
3. 轉(zhuǎn)膜：在塑料槽中倒入一定量的甲醇，將所需的PVDF膜用簽字筆寫上相關(guān)信息做好標記，將膜浸入甲醇中浸泡，將其激活，使其更易與蛋白質(zhì)結(jié)合。將轉(zhuǎn)膜夾和兩個海綿墊用純水洗凈后放入盒中（轉(zhuǎn)膜夾黑面在下），加入轉(zhuǎn)移液直至浸沒海綿，取3層濾紙浸潤轉(zhuǎn)移液后放于轉(zhuǎn)膜夾黑面上，用玻璃管趕去氣泡，將膠取出（膠體有毒，要戴手套操作），切除濃縮膠和多余的分離膠（丟棄到垃圾桶里，不能放到洗手池中，防止堵塞下水道），將分離膠倒置于濾紙上，放PVDF膜，放三層濾紙，每步操作之后都需要趕走夾層中的氣體（殘留的氣體會影響到轉(zhuǎn)膜的效果）。轉(zhuǎn)膜夾夾好，放入槽中，將轉(zhuǎn)移液倒?jié)M槽。將電泳盒放入盆中，加冰，保證電泳盒周圍被冰塊圍繞，再加入一定量的水，蓋上蓋子，設(shè)置電流160mA恒流，轉(zhuǎn)膜3h后，停止轉(zhuǎn)膜，關(guān)閉電泳儀。
4. 封閉：將轉(zhuǎn)膜得到的PVDF膜取出，可以觀察到清晰的Marker條帶，放入1×TBST中洗一下。放入封閉液中30分鐘。
5. 用加了吐溫的TBS洗PVDF膜8分鐘×3次，再用TBS洗膜8min，清洗完畢后，取一泡沫板，放上干凈的一次性塑料手套，再放上膜，用濾紙吸干水分，根據(jù)所需孵育一抗的分子量，用鋒利的刀將膜裁開，標記上所孵育的蛋白，放入提前配置好的一抗如GAPDH、IRE1α、GRP78中4℃孵育，孵育20h。
6. 孵育20h后將膜取出，TBST洗膜8min×3次，在*后一遍時根據(jù)一抗的種類配置二抗。將洗好的膜放入二抗溶液中，4攝氏度2h。TBST洗膜8分鐘×3次，TBS洗8min。
7. 打開顯影儀，配置顯影液。用濾紙將顯影板擦干凈，夾取需要顯影的膜到顯影板上，不要產(chǎn)生氣泡，滴加顯影液，放入顯影儀中顯現(xiàn)結(jié)果，拍照記錄，根據(jù)需要調(diào)整圖片，得到清晰的條帶，修改圖片名稱，做好記錄。重復(fù)上述操作給其他的PVDF膜顯影。結(jié)束后將圖片保存到自己的優(yōu)盤里。