一、基本原理

Western Blot 通過(guò)電泳將蛋白質(zhì)分離，然后將分離后的蛋白質(zhì)從凝膠轉(zhuǎn)移到固相載體（如硝酸纖維素膜或 PVDF 膜）上。接著，利用特異性抗體與目的蛋白結(jié)合，再通過(guò)標(biāo)記的二抗進(jìn)行檢測(cè)，以確定目的蛋白的存在、大小和相對(duì)豐度。

二、主要步驟

1. 提蛋白：取根據(jù)分組給藥處理48h過(guò)的六孔板中的細(xì)胞，將6孔板中上清用移液器棄掉，每孔用1ml 1×PBS潤(rùn)洗2次，吸凈孔中液體，用0.5毫升的胰酶消化，室溫條件下一分鐘作用。終止消化后將細(xì)胞吹下來(lái)，盡量不要產(chǎn)生氣泡。
2. 轉(zhuǎn)移到EP管中，做上標(biāo)記并配平后，1000rpm，5min，保留細(xì)胞沉淀，每管加入150μl細(xì)胞裂解液（100μl ripa+1μl pmsf，需提前從-20℃冰箱拿出化凍），吹打混勻。置于冰上裂解半小時(shí)，放入-80℃冰箱，凍融3次，打開(kāi)高速低溫離心機(jī)，溫度降低到4℃才可以使用，離心機(jī)14000轉(zhuǎn)離心30min（高速離心機(jī)使用時(shí)一定要配平）。用10μl移液器小心吸取上清，不要沉淀。
3. BCA定量：

(1)    首先，需要準(zhǔn)備標(biāo)準(zhǔn)蛋白溶液。我們移液器吸取15微升的標(biāo)準(zhǔn)蛋白溶液（濃度為10mg/ml）到EP管中，然后再添加285μl的生理鹽水，從而得到濃度為0.5mg/ml的標(biāo)準(zhǔn)蛋白溶液。接著，按照表4中預(yù)先設(shè)計(jì)好的濃度梯度，配置8管不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)蛋白溶液。

表 標(biāo)準(zhǔn)蛋白梯度濃度配制

(2)    接下來(lái)，對(duì)蛋白樣品進(jìn)行稀釋。我們?nèi)?2μl的生理鹽水到EP管中，做好標(biāo)記，再加入8微升的蛋白樣品，將其混勻，相當(dāng)于稀釋10倍。這一步的目的是使樣品的濃度范圍與標(biāo)準(zhǔn)蛋白溶液的濃度范圍相匹配，以便后續(xù)進(jìn)行比較和分析。

(3)    按照分組，每組三個(gè)復(fù)孔，每孔20微升樣品和200μl的AB液混合液。

(4)    隨后，將96孔板板蓋拿掉后放入酶標(biāo)儀中，在37攝氏度條件下間隔振蕩30分鐘。這一步的目的是讓AB液與蛋白質(zhì)發(fā)生反應(yīng)，形成有色化合物，其顏色深淺與蛋白質(zhì)的濃度成正比。

(5)    *后，測(cè)量每個(gè)孔的吸光度值，然后分析數(shù)據(jù)。

(6)    根據(jù)BCA定量的結(jié)果調(diào)整樣品蛋白的濃度，使各組的濃度相同，用ripa作為稀釋液稀釋，再加入等同于蛋白溶液體積1/4的5×loading buffer，用渦旋混勻器混勻后，在電磁爐中水浴100℃ 15min，降到室溫后放入-80℃冰箱中保存。

4. 制膠：用去離子水將玻璃板沖洗干凈，晾干后裝配到夾板上。用超純水檢漏，確定不漏后棄去板縫中的超純水，用濾紙吸干。根據(jù)實(shí)驗(yàn)要求，按照配方配制10%的分離膠，配置過(guò)程中需注意AP*后加，并且要快速地混勻；混勻后用移液器沿著板縫邊緣緩緩加入7ml分離膠，盡量不要產(chǎn)生氣泡，加完后，沿板縫上方來(lái)回移動(dòng)緩慢加入1ml異丙醇。靜置25分鐘左右分離膠就會(huì)凝固。將異丙醇倒掉，用濾紙吸附殘余的異丙醇。將1.5mm、10孔規(guī)格的梳子用純水洗干凈，插入板縫中間。按照配方配置5%的濃縮膠，混勻后用移液器抵著梳子和玻璃板邊緣之間的縫隙加入，移液器中液體不要打完，避免產(chǎn)生氣泡。加滿后室溫靜置至完全凝固（25min左右）。
5. 上樣：將蛋白樣品、Marker以及1×loading buffer取出置于冰上化凍，因?yàn)榈鞍踪|(zhì)容易降解，所以必須要放到冰上化凍。將制好的膠放入電泳槽中，量取30ml的10×電泳液用純水稀釋到300ml，得到1×電泳液，在板中間加電泳液，直到溢出到槽中。拔掉梳子，按照順序?qū)悠沸⌒亩志徛丶尤氲侥z孔內(nèi)，剩下的孔用1×loading buffer補(bǔ)齊，防止樣品飄逸。
6. 電泳：將電泳盒的蓋子蓋好，注意電極的正負(fù)，設(shè)置恒壓80v，開(kāi)始后電泳盒中有小氣泡產(chǎn)生，則說(shuō)明有電流回路。大約四五十分鐘后，觀察Marker的位置，若Marker已完全分開(kāi)，則將電壓改為恒壓120v，繼續(xù)電泳直至loading跑至分離膠底部時(shí)關(guān)閉電泳儀。
7. 轉(zhuǎn)膜：在塑料槽中倒入一定量的甲醇，將所需的PVDF膜用簽字筆寫(xiě)上相關(guān)信息做好標(biāo)記，將膜浸入甲醇中浸泡，將其激活，使其更易與蛋白質(zhì)結(jié)合。將轉(zhuǎn)膜夾和兩個(gè)海綿墊用純水洗凈后放入盒中（轉(zhuǎn)膜夾黑面在下），加入轉(zhuǎn)移液直至浸沒(méi)海綿，取3層濾紙浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移液后放于轉(zhuǎn)膜夾黑面上，用玻璃管趕去氣泡，將膠取出（膠體有毒，要戴手套操作），切除濃縮膠和多余的分離膠（丟棄到垃圾桶里，不能放到洗手池中，防止堵塞下水道），將分離膠倒置于濾紙上，放PVDF膜，放三層濾紙，每步操作之后都需要趕走夾層中的氣體（殘留的氣體會(huì)影響到轉(zhuǎn)膜的效果）。轉(zhuǎn)膜夾夾好，放入槽中，將轉(zhuǎn)移液倒?jié)M槽。將電泳盒放入盆中，加冰，保證電泳盒周圍被冰塊圍繞，再加入一定量的水，蓋上蓋子，設(shè)置電流160mA恒流，轉(zhuǎn)膜3h后，停止轉(zhuǎn)膜，關(guān)閉電泳儀。
8. 封閉：將轉(zhuǎn)膜得到的PVDF膜取出，可以觀察到清晰的Marker條帶，放入1×TBST中洗一下。放入封閉液中30分鐘。
9. 用加了吐溫的TBS洗PVDF膜8分鐘×3次，再用TBS洗膜8min，清洗完畢后，取一泡沫板，放上干凈的一次性塑料手套，再放上膜，用濾紙吸干水分，根據(jù)所需孵育一抗的分子量，用鋒利的刀將膜裁開(kāi)，標(biāo)記上所孵育的蛋白，放入提前配置好的一抗中4℃孵育，孵育20h。
10. 孵育20h后將膜取出，TBST洗膜8min×3次，在*后一遍時(shí)根據(jù)一抗的種類配置二抗。將洗好的膜放入二抗溶液中，4攝氏度2h。TBST洗膜8分鐘×3次，TBS洗8min。
11. 打開(kāi)顯影儀，配置顯影液。用濾紙將顯影板擦干凈，夾取需要顯影的膜到顯影板上，不要產(chǎn)生氣泡，滴加顯影液，放入顯影儀中顯現(xiàn)結(jié)果，拍照記錄，根據(jù)需要調(diào)整圖片，得到清晰的條帶，修改圖片名稱，做好記錄。重復(fù)上述操作給其他的PVDF膜顯影。結(jié)束后將圖片保存到自己的優(yōu)盤(pán)里。

三、應(yīng)用領(lǐng)域

1. 蛋白質(zhì)表達(dá)分析：檢測(cè)特定蛋白質(zhì)在不同組織、細(xì)胞或不同處理?xiàng)l件下的表達(dá)水平變化。

2. 蛋白質(zhì)定位研究：確定蛋白質(zhì)在細(xì)胞內(nèi)的定位。

3. 蛋白質(zhì)相互作用研究：通過(guò)共免疫沉淀結(jié)合 Western Blot 檢測(cè)蛋白質(zhì)之間的相互作用。

4. 疾病診斷和研究：在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，用于檢測(cè)疾病相關(guān)蛋白質(zhì)的表達(dá)變化，為疾病的診斷和研究提供依據(jù)。

四、實(shí)驗(yàn)服務(wù)

分子實(shí)驗(yàn)平臺(tái)：高效運(yùn)作了qRT-PCR、Western blot、雙向電泳技術(shù)、分子克隆與質(zhì)粒構(gòu)建、流式細(xì)胞儀檢測(cè)、免疫共沉淀、染色質(zhì)免疫共沉淀、RNA免疫沉淀、凝膠電泳遷移實(shí)驗(yàn)、酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定、外泌體抽提及鑒定等實(shí)驗(yàn)。

基因組學(xué)平臺(tái)：可以完成甲基化檢測(cè)、基因芯片分析、高通量測(cè)序等實(shí)驗(yàn)。

蛋白組學(xué)平臺(tái)：能實(shí)現(xiàn)LC-MS、ITRAQ、蛋白質(zhì)修飾分析等重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目。

病理學(xué)平臺(tái)：涉及免疫熒光染色、免疫組織化學(xué)染色、HE染色、特殊染色等實(shí)驗(yàn)。

生物信息學(xué)分析：文本挖掘，芯片表達(dá)譜分析，序列分析，轉(zhuǎn)錄因子靶點(diǎn)預(yù)測(cè)，高通量測(cè)序數(shù)據(jù)分析等項(xiàng)目

臨床前CRO服務(wù)：主要提供呼吸系統(tǒng)、神經(jīng)系統(tǒng)、免疫系統(tǒng)性疾病的藥效學(xué)評(píng)價(jià)服務(wù)，包括靶點(diǎn)驗(yàn)證、體內(nèi)外模型的構(gòu)建、藥物篩選、藥物分析、藥效性評(píng)價(jià)、藥代動(dòng)力學(xué)和藥理學(xué)研究以及院內(nèi)制劑研發(fā)等。

項(xiàng)目轉(zhuǎn)化服務(wù)：助力客戶進(jìn)行方案設(shè)計(jì)、聯(lián)合課題申報(bào)、藥物項(xiàng)目引進(jìn)和孵化，解決客戶對(duì)實(shí)驗(yàn)技術(shù)平臺(tái)、專業(yè)人才、zhuanli申請(qǐng)和融資的需求；

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