細胞實驗是在體外對細胞進行的一系列操作和觀察，以研究細胞的生物學(xué)特性、生理功能、疾病機制以及藥物反應(yīng)等。以下是細胞實驗的一些常見類型和要點：

一、常見細胞實驗類型

1. 細胞培養(yǎng)

- 目的：維持細胞的生存和生長，為其他實驗提供細胞來源。

- 步驟：選擇合適的細胞系，準備培養(yǎng)基和培養(yǎng)容器，進行細胞接種、傳代和凍存等操作。

2. 細胞增殖實驗

- 目的：檢測細胞的生長和分裂能力。

- 方法：

①　MTT法:是一種檢測細胞存活和生長的方法。該方法已廣泛于生物活性因子的活性檢測、抗腫瘤藥物篩選、細胞毒性試驗以及腫瘤放射敏感性測定等。它的特點是靈敏度高、經(jīng)濟、快捷。原理:活細胞線粒體中的琥珀酸脫氫酶能使外源性MTT還原為水不溶性的藍紫色結(jié)晶甲瓚( Formazan )并沉積在細胞中,而死細胞無此功能。二甲基亞砜( DMSO )能溶解細胞中的甲瓚,用酶聯(lián)免疫檢測儀在490nm波長處測定其吸光度值,可間接反 映活細胞數(shù)量。在一定細胞數(shù)范圍內(nèi), MTT結(jié)晶形成的量與細胞數(shù)成正比。

②　CCK-8法:可用于簡便而準確的細胞增殖和毒性分析,常用于藥物篩選、細胞增殖測定、細胞毒性測定、腫瘤藥敏試驗。原理:該試劑中含有WST-8 [化學(xué)名: 2-(2-甲氧基4-硝基苯基)-3-(4-硝基苯基)-5-(2,4-二磺酸苯)-2H-四唑單鈉鹽], 它在電子載體1-甲氧基 -5-甲基吩嗪諭硫酸_二甲酯( 1-Methoxy PMS )的作用下被細胞中的脫氫酶還原為具有高度水溶性的黃色甲瓚產(chǎn)物( Formazan dye )。生成的甲瓚物的數(shù)量與活細胞的數(shù)量成正比。因此可利用這一特性直接進行細胞增殖和毒性分析。

③　Brdu:即5- Bromo-2'-Deoxyuridine,中文全名5溴脫氧尿嘧啶核苷,為胸腺嘧啶的衍生物,可代替胸腺嘧啶在DNA合成期, S期活體注射或細胞培養(yǎng)加入。而后利用抗Brdu單克隆抗體ICC染色顯示增殖細胞。同時結(jié)合其它細胞標記物雙重染色可判斷增殖細胞的種類,增殖速度,對研究細胞動力學(xué)有重要意義。但由于抗體分子量大,難于摻入并被有效檢測。因此BrdU檢測需采用DNA酶或HCI或加熱使DNA變性。這些處理方法能夠破壞抗原識別位點,此外許多細胞周期分析的染料都需要dsDNAD這種處理方法也使得同一樣本無法同時進行細胞周期分析。

④　EDU:即5-Ethynyl-2' - deoxyuridine,是-種胸腺嘧啶核苷類似物,能夠在細胞增殖時期
 代替胸腺嘧啶(T )滲入正在復(fù)制的DNA分子中。通過基于EdU與Apollo熒光染料的特異性反應(yīng)快速檢測細胞DNA復(fù)制活性,適用于細胞增殖、細胞分化、生長與發(fā)育、DNA修復(fù)、病毒復(fù)制、細胞標記示蹤等方面的研究,尤其適合進行siRNA、miRNA、 小分子化合物及其他藥物的篩選實驗。

3. 細胞毒性實驗

- 目的：評估藥物、化學(xué)物質(zhì)或其他因素對細胞的毒性作用。

- 常見方法：LDH 釋放法、臺盼藍染色法等，檢測細胞損傷或死亡情況。

4. 細胞凋亡實驗

- 目的：研究細胞的程序性死亡過程。

- 方法：如 Annexin V/PI 染色、TUNEL 染色等，檢測凋亡細胞的特征。

   ANNEXIN V-PI法:在正常細胞中,磷脂酰絲氨酸( PS )只分布在細胞膜脂質(zhì)雙層的內(nèi)側(cè),而在細胞凋亡早期,細胞膜中的磷脂酰絲氨酸( PS )由脂膜內(nèi)側(cè)翻向外側(cè)。Annexin V是一種分子量為35~ 36kD的Ca2+依賴性磷脂結(jié)合蛋白,與磷脂酰絲氨酸有高度親和力,故可通過細胞外側(cè)暴露的磷脂酰絲氨酸與凋亡早期細胞的胞膜結(jié)合。因此Annexin V被作為檢測細胞早期凋亡的靈敏指標之- -。將Annexin V進行熒光素( EGFP、FITC )標記,以標記了的Annexin V作為熒光探針,利用熒光顯微鏡或流式細胞儀可檢測細胞凋亡的發(fā)生。碘化丙啶( Propidium Iodide, PI) 是一種核酸染料,它不能透過完整的細胞膜,但對凋亡中晚期的細胞和死細胞, PI能夠透過細胞膜而使細胞核染紅。因此將Annexin V與PI匹配使用,就可以將處于不同凋亡時期的細胞區(qū)分開來。

5. 細胞遷移和侵襲實驗

- 目的：觀察細胞的運動能力和侵襲性。

- 包括細胞劃痕實驗、Transwell 實驗等。

①　1. Transwell :是一種侵襲實驗技術(shù),其實原理簡單地說就是用一層膜將高營養(yǎng)的培養(yǎng)液和低營養(yǎng)的培養(yǎng)液隔開,細胞放在低營養(yǎng)的培養(yǎng)液里,為了找吃的,細胞會往高營養(yǎng)的培養(yǎng)液里面跑,但是有膜擋著,所以要穿過膜才行。我們在膜上涂上- -層基質(zhì)膠,模仿細胞外基質(zhì),于是細胞要把基質(zhì)消化了才可以從低營養(yǎng)的培養(yǎng)液跑到高營養(yǎng)的培養(yǎng)液里面,后我們檢測高營養(yǎng)的培養(yǎng)液里細胞量就可以知道細胞的侵襲能力了。
 

②　2.劃痕實驗:是簡捷測定細胞遷移運動與修復(fù)能力的方法,類似體外傷口yu he模型,在體外培養(yǎng)皿或平板培養(yǎng)的單層貼壁細胞上,用微量槍頭或其它硬物在細胞生長的中央?yún)^(qū)域劃線,去除中央部分的細胞,然后繼續(xù)培養(yǎng)細胞至實驗設(shè)定的時間(例如72h),取出細胞培養(yǎng)板,觀察周邊細胞是否生長(修復(fù))至中央劃痕區(qū),以此判斷細胞是否生長(修復(fù))至中央劃痕區(qū),以此判斷細胞的生長遷移能力, 實驗通常需設(shè)定正常對照組和實驗組,實驗組是加了某種處理因素或藥物、外源性基因等的組別,通過不同分組之間的細胞對于劃痕區(qū)的修復(fù)能力，可以判斷各組細胞的遷移與修復(fù)能力。

6. 基因轉(zhuǎn)染實驗

- 目的：將外源基因?qū)爰毎?，研究基因功能或進行細胞zhi liao。

- 方法：如脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染、電穿孔轉(zhuǎn)染等。

二、實驗要點

1. 細胞選擇

- 根據(jù)實驗?zāi)康倪x擇合適的細胞系，考慮細胞的來源、特性和生物學(xué)功能。

- 確保細胞的質(zhì)量和純度，避免污染和交叉污染。

2. 實驗設(shè)計

- 明確實驗?zāi)康暮图僭O(shè)，設(shè)計合理的對照組和實驗組。

- 確定實驗的樣本量和重復(fù)次數(shù)，以保證結(jié)果的可靠性。

3. 實驗操作

- 嚴格遵守?zé)o菌操作規(guī)范，防止細胞污染。

- 準確控制實驗條件，如溫度、濕度、CO?濃度等。

- 按照實驗步驟進行操作，注意操作的準確性和一致性。

4. 結(jié)果分析

- 選擇合適的數(shù)據(jù)分析方法，對實驗結(jié)果進行統(tǒng)計分析。

- 結(jié)合實驗?zāi)康暮图僭O(shè)，對結(jié)果進行合理的解釋和討論。

5. 注意事項

- 處理細胞和試劑時，要注意an quan，避免接觸有毒有害物質(zhì)。

- 遵守實驗室的an quan規(guī)定，正確使用實驗設(shè)備和防護用品。

細胞實驗是生物學(xué)、醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域研究的重要手段，通過合理的實驗設(shè)計和操作，可以為揭示生命現(xiàn)象和疾病機制提供有力的支持。