二. 免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)步驟

1.用RIPA裂解緩沖液裂解細(xì)胞；

2.用PBS配制成50%的protein A/G-agarose工作液；

3.在樣品中以每1ml中加100μl的比例，加入50%的Protein A/G agarose工作液。水平搖床4℃搖動(dòng)10min（該步驟的目的是去除非特異性結(jié)合的蛋白）；

4.4℃，14000g離心15min，將上清轉(zhuǎn)移到一個(gè)新的離心管中，去除protein A/G-agraose微球；

5.使用BCA法或者其他方法測定總蛋白的濃度；

6.加入體積的一抗，至總體積約為500μl；

8.用搖床緩慢搖動(dòng)抗原抗體混合物，4℃過夜；注意：如果如果下游用于激酶或磷酸酶的酶活測定，則好將11步改為室溫孵育2h；

9.14000g離心5s，收集沉淀，并且用預(yù)冷的洗滌緩沖液（或者預(yù)冷的PBS）洗滌3遍（每次加入800μl）

10.（用合適體積的上樣緩沖液重懸）收集上清，用于進(jìn)一步的下游SDS-PAGE、western-blot或者質(zhì)譜分析。通過免疫共沉淀，確定結(jié)合蛋白。

三.常見問題解解決辦法

1、抗體洗脫過多，怎么辦？

解決辦法：降低抗體用量；在進(jìn)行IP前將抗體交聯(lián)到珠子上；使用梯度甘氨酸緩沖洗脫液。

2、洗脫液中檢測不到靶蛋白，怎么辦？

原因	解決辦法
標(biāo)本中無靶蛋白表達(dá)，或者表達(dá)量非常低	根據(jù)蛋白表達(dá)資料確定檢測標(biāo)本中有靶蛋白的表達(dá)。如果蛋白表達(dá)水平很低，可以考慮增加裂解物的用量，但這樣會(huì)增加非特異性結(jié)合。因此建議在進(jìn)行IP前先對裂解物進(jìn)行預(yù)純化
所有抗體量不足，難以捕獲靶蛋白	根據(jù)推薦量使用抗體，并根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果優(yōu)化抗體的用量.
靶蛋白沒有從珠子上洗脫下來	確定使用正確的洗脫液并洗脫液的強(qiáng)度和pH值是適用于靶蛋白的
抗體沒有和免疫吸附的珠子結(jié)合	確定使用正確的洗脫液并洗脫液的強(qiáng)度和pH值是適用于靶蛋白的
抗體沒有和免疫吸附的珠子結(jié)合	根據(jù)說明書確定該抗體檢測的是變性還是天然蛋白；然后所用裂解液是恰當(dāng)?shù)?/span>

答： 細(xì)胞裂解采用溫和的裂解條件，不能破壞細(xì)胞內(nèi)存在的所有蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用或抗原的結(jié)構(gòu)，多采用非離子變性劑(NP40 或Triton X-100)。每種細(xì)胞的裂解條件是不一樣的，通過經(jīng)驗(yàn)確定。不能用高濃度的變性劑(0.2%SDS)，細(xì)胞裂解液中要加各種酶抑制劑。

四. 應(yīng)用

1、腫瘤：鼻咽癌細(xì)胞中P53相結(jié)合蛋白質(zhì)的分離和鑒定：免疫共沉淀與LC2ESI2MS/MS分析相結(jié)合的方法對HNE1細(xì)胞蛋白條帶3鑒定的P53相互作用蛋白之一HSP78進(jìn)行了驗(yàn)證。次在鼻咽癌細(xì)胞中鑒定了九個(gè)P53結(jié)合蛋白，為闡明鼻咽癌中P53蛋白聚集及失活的機(jī)制提供了重要依據(jù)和線索。