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免疫熒光注意的細節(jié)
日期：2025-05-01 22:11
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摘要：
免疫熒光方法中的重要環(huán)節(jié)及注意事項
1、冰凍切片制備：建議用新鮮組織，否則組織細胞內部結構可能破壞，易使抗原彌散。選用干凈鋒利的刀片、組織要冷凍適度等，防止裂片和脫片嚴重。
2、組織切片固定：切好片風干后立即用冰丙酮等固定液進行固定 5-10 min，尤其要較長時間保存的白片，要及時固定和適當保存。
3、血清封閉：為防止內源性非特異性蛋白抗原的結合，需要在一抗孵育前先用血清（與二抗來源致）封閉，減弱背景著色。血清封閉的時間是可以調整的，一般 10-30 min。
4、一抗孵育條件...
免疫熒光方法中的重要環(huán)節(jié)及注意事項
1、冰凍切片制備：建議用新鮮組織，否則組織細胞內部結構可能破壞，易使抗原彌散。選用干凈鋒利的刀片、組織要冷凍適度等，防止裂片和脫片嚴重。
2、組織切片固定：切好片風干后立即用冰丙酮等固定液進行固定 5-10 min，尤其要較長時間保存的白片，要及時固定和適當保存。
3、血清封閉：為防止內源性非特異性蛋白抗原的結合，需要在一抗孵育前先用血清（與二抗來源致）封閉，減弱背景著色。血清封閉的時間是可以調整的，一般 10-30 min。
4、一抗孵育條件：在免疫組化反應中重要，包括孵育時間和抗體濃度。一抗孵育溫度有幾種：4℃ 、室溫、37℃ ，其中 4℃ 效果佳；孵育時間：這與溫度、抗體濃度有關，一般 37℃ 1-2 h，而 4℃ 過宿和從冰箱拿出后 37℃ 復溫 45 min。具體條件還要摸索。
5、二抗孵育條件：二抗一般室溫或 37℃ 立即觀察，若將標本放在聚乙烯塑料袋中 4℃ 30 min-1h，具體時間需要摸索，而濃度一般有工作液，若是濃縮還要摸索濃度液，切記要避光反應。但在免疫熒光中我們一般先把二抗?jié)舛群头跤龝r間先定下，然后去摸索一抗?jié)舛群头跤龝r間。后，免疫熒光中熒光素標記的二抗隨著保存時間的延長，可能后有大量的游離熒光素殘留，需要注意配制時小包裝和并進行適當?shù)碾x心。
6、復染：目的是形成細胞輪廓，從而更好地對目標蛋白進行定位。一般常用 DAPI 復染。
