一、樣品制備的基本原則

代表性原則：取樣的代表性直接關系到實驗結(jié)果的后解釋和后續(xù)分析的的準確性和科學性。實驗樣品取樣，包括樣品類型，取樣的操作流程，實驗分組的設定。基本要求實驗處理組和對照組的樣品在取材方式和處理條件等方面盡可能保持一致，否則可能會影響實驗結(jié)果的重復性和可信度。

準確性原則：取樣的準確性直接關系到實驗結(jié)果的科學意義。所有樣品取材被準確記錄，并按要求（低溫、迅速）采集、制備、貯存、運輸，終正確地按實驗設計進行實驗和數(shù)據(jù)處理，以減少外界因素對樣品影響，后的實驗結(jié)果能夠真實的反應樣品的狀態(tài)。

低溫原則：所取樣本離體后，應立即置于液氮中，并在實驗前始終處于-70℃以下，以避免RNA的降解。

規(guī)范性原則：實驗過程包括樣品收集、貯存、運輸以及后續(xù)處理是決定芯片實驗結(jié)果的穩(wěn)定性和可信度的關鍵因素，因此制訂和嚴格執(zhí)行規(guī)范化芯片樣品的制備規(guī)范操作流程。

二、高通量測序Total RNA和DNA用量標準

1、高通量測序DNA用量標準

注意事項：

1）總量不足或濃度過低：可能文庫構(gòu)建失敗；可能文庫產(chǎn)量低不能上機測序或測序數(shù)據(jù)量不足；可能影響文庫隨機性、數(shù)據(jù)覆蓋度可能偏低；ChIP樣品可能存在adapter污染率偏高。

2）DNA定量： NanoDrop定量結(jié)果只會作為參考而不會用于總量計算，因為NanoDrop是基于紫外吸收峰OD值進行定量，包括DNA、RNA、蛋白質(zhì)、鹽離子或其他有機物質(zhì)等在260nm均有吸收值，容易造成讀數(shù)偏高，NanoDrop或分光光度計等結(jié)果可能比Qubit定量高出2-10倍；而Qubit定量是通過特異性結(jié)合到雙鏈DNA的熒光染料進行定量，定量結(jié)果更為準確，后定量以Qubit定量結(jié)果為準。

3）樣品進行檢測時少需要消耗1-2μl樣品，建議樣品體積大于10μl。

4）DNA樣品應盡量避免多糖、蛋白質(zhì)和外切酶的殘留；樣品注明溶劑成分。 

2、高通量測序Total RNA用量標準

注意事項：

1) RNA總量不足或過低：可能導致文庫構(gòu)建失敗、文庫產(chǎn)量低不能上機測序；可能導致RNA-Seq數(shù)據(jù)duplication比例高，隨機性差。

2) 降解樣品：可能導致建庫失?。豢赡軐е翿NA-Seq數(shù)據(jù)duplication比例高，隨機性差；可能導致Small RNA rRNA污染比例高，影響有效數(shù)據(jù)。

3) Small RNA含量低：部分樣品total RNA達到要求，但是由于樣品特異性，small RNA含量遠遠低于正常樣品（如培養(yǎng)細胞等），可能導致建庫失敗。

4) Small RNA（<200nt）樣品：無法判斷RNA的完整性，對樣品中降解的rRNA/tRNA比例無法預估，文庫中可能rRNA/tRNA污染比例高，嚴重影響有效數(shù)據(jù)。

5) 蛋白或其他不溶雜質(zhì)污染：可能影響RNA-Seq過程中磁珠分離mRNA及反轉(zhuǎn)錄效率，導致建庫失敗。

6) “去rRNA樣品”中仍殘留有rRNA：可能導致rRNA比例高，有效數(shù)據(jù)偏少。

7) cDNA，mRNA樣品：很難檢測RNA完整性，質(zhì)量無法。

三、組織樣本制備

3.1  DNA組織及血液樣品標準

3.2  DNA組織樣品采集方法

3.2.1 植物組織 ：大田或野外獲取的材料，取材后需用70%酒精將材料表面的灰塵及泥土沖洗干凈，吸干， 液氮速凍后，放入預冷的50ml離心管或是封口袋中，干冰運輸，開箱檢驗時有足夠的干冰剩余。 

3.2.2 動物組織 ：準備好用于包裝樣品的鋁箔或冷凍保存管，并且用油性記號筆在鋁箔或凍存管外表多處寫明樣品編號；活體取材后的組織用RNase-free 的0.9％生理鹽水中漂洗樣品，去除血漬和污物，并剔除結(jié)締組織和脂肪組織等非研究所需的組織類型，吸干，并將樣品分割成50mg左右的小塊（組織塊越小，保存效果越好），放入鋁箔或冷凍保存管中，液氮速凍后用封口膜封口，再將冷凍保存管放置于50ml離心管中或封口袋中，干冰運輸，在收到樣品開箱檢驗時有足夠的干冰剩余。 

3.2.3血液 ：要求為全血樣本，并加入抗凝劑，推薦使用 EDTA 抗凝的采血管收集樣品（由于會影響實驗，不能使用肝素抗凝），冷凍后，干冰運輸送樣。

3.2.4 離體培養(yǎng)細胞 ：貼壁細胞或懸浮細胞培養(yǎng)結(jié)束后，去除培養(yǎng)液；用PBS 緩沖液快速洗一次，除去PBS 緩沖液，貼壁細胞可用細胞刮將其刮下；收集的細胞轉(zhuǎn)入1.5 ml的EP管中用液氮速凍后，干冰運輸。

注意事項：

1) 對腫瘤組織的取材，應盡可能準確地判定腫瘤組織和正常組織；

2) 用于DNA抽提的樣品制備處理及切割過程應在冰上盡可能快速進行，時間過長會導致樣品DNA降解 。

3) 在臨床手術過程中采集的病理或正常樣品，如果沒有條件立即從手術室中取出進行后續(xù)處理，應在切除后立即轉(zhuǎn)移到液氮中保存。

3.3  RNA組織及血液樣品標準

3.4 RNA組織樣品采集方法

3.4.1 植物組織 ：大田或野外獲取的材料，取材后需用DEPC-H₂O將材料表面的灰塵及泥土沖洗干凈，吸干，并將樣品分割成100mg左右的小塊放入1.5ml或者2.0ml的RNase-free的EP 管中，加入RNAlater或類似的RNA組織保存試劑，并嚴格按照使用說明進行操作。如蠟表皮的葉組織可能需要先破壞其屏障，以允許RNAlater 進入組織，液氮速凍后用封口膜封口，再將EP管放置于50ml 離心管中或密封性好的小塑料袋中，干冰運輸，收到樣品時有足夠的干冰剩余。

3.4.2 動物組織 ：活體取材后的組織需迅速用RNase-free 的0.9％生理鹽水漂洗，以去除血漬和污物，并剔除結(jié)締組織和脂肪組織等非研究所需的組織類型，吸干，并將樣品分割成50mg左右的小塊（組織塊越小，保存效果越好），放入1.5ml 或者2.0ml的RNase-free 的EP 管中，并加入RNAlater 一類的RNA 組織保存試劑，液氮速凍后用封口膜封口，再將EP 管放置于50ml 離心管中或密封性好的小塑料袋中，用干冰運輸，收到樣品時有足夠的干冰剩余。

微量樣本建議浸入液氮冷凍后，在有液氮保護下將組織研磨成粉末并加入足量的裂解液裂解，參考用量為60mg/ml Trizol，常溫裂解5min后，大體積干冰運輸。

3.4.3貼壁細胞 ： 

1. 貼壁細胞培養(yǎng)或處理結(jié)束后，去除培養(yǎng)液；

2. 按每10 cm² 培養(yǎng)面積加1 mL Trizol 試劑的比例加入Trizol 試劑；

3. 用1 mL槍頭反復吹打, 使Trizol接觸所有長有細胞的培養(yǎng)瓶表面進行充分消化；

4. 轉(zhuǎn)移到RNase-free 的試管中用一次性注射器進行反復抽打細胞直至看不見成團的細胞塊，整個溶液應該為清亮而且不粘稠的狀態(tài)；

5. 放入干冰運輸或-80℃冰箱中保存。

3.4.4懸浮細胞 ：

1. 懸浮細胞培養(yǎng)或處理結(jié)束后，去除培養(yǎng)液；

2. 保留的細胞用PBS 緩沖液快速洗一次，離心除去PBS 緩沖液；

3. 按照每5×10⁶ 個細胞加1 mL Trizol 的比例加入Trizol 試劑，用一次性注射器進行反復抽打細胞直至看不見成團的細胞塊，整個溶液呈清亮而不粘稠的狀態(tài)；

4. 放入干冰運輸或-80℃冰箱中保存。

3.4.5血液： 

1. 在已加入EDTA的新鮮全血中加入等體積PBS（1×），充分混勻；

2. 緩慢轉(zhuǎn)入另一已加入**細胞分離液的離心管中，并使上述混合液處于**細胞分離液液面之上（即兩種液體不要混合，保留清晰的界面），3000 g 離心30 min；

3. 用移液槍小心分離出白細胞層；用PBS（1×）清洗白細胞，離心回收白細胞，棄去上清；

4. 加入白細胞20倍體積的Trizol 試劑，用一次性注射器或移液器進行反復抽打細胞直至看不見成團的細胞塊，整個溶液呈清亮而不粘稠的狀態(tài)；

5. 放入干冰或-80℃冰箱中保存。

血液特殊處理：全血樣品要求客戶在新鮮樣品時加入全血3倍體積的Trizol LS裂解液混勻后裂解后放-80℃保存，干冰運輸，以防止RNA降解； 

血清樣品處理：全血樣品收集后，馬上離心收集血清，然后在血清中加入血清3倍體積的Trizol LS，混勻后-80℃保存，用干冰運輸 

注意事項：

組織量不足：RNA產(chǎn)量低，未達到建庫要求的起始量，文庫建庫可能失敗。特別是植物類組織，由于植物葉片、果實、塊根或根莖含有高濃度的多糖多酚物質(zhì)，以及其他復雜的未知成分，提取難度較大，因此送樣量。

反復凍融的組織：RNA降解的概率在80%以上，RNA不可能提取成功，RNA的質(zhì)量難以滿足建庫要求，此類組織不建議送樣。尤其針對動物肝臟、脾臟、胰腺、腎臟、心臟、脂肪、大腦組織或腫瘤組織等一類RNase活躍的組織。

長年保存的組織：組織樣本保存時間超過一年或以上，RNA提取風險加大，RNA質(zhì)量較差，不建議送樣。

離體組織：動植物類組織，如植物老根、果實等，動物肝臟、脂肪、腦組織等，這類組織RNase非?；钴S，組織部位離體后，務必在半分鐘內(nèi)將離體組織用液氮速凍，放入-80℃冰箱中保存，或液氮下切割成2-3mm厚的小塊，浸入RNAlater保護試劑保存。如果組織離體超過1分鐘未進行處理，則活躍的RNase很可能以驚人的速度降解RNA，RNA的質(zhì)量難以保持。

全血類：為提取成功率，客戶做好**細胞分離工作，并加入 Trizol裂解液保存再送樣。如果分離**細胞條件不允許，也請將新鮮收集的全血以約60ul的量裝入RNAprotect® Animal Blood Tubes（100μl）（QIAGEN公司）。如果以上三種全血樣品保存方法均難以做到，請客戶自行提取。如果客戶堅持送樣，由客戶承擔責任和提取風險。

困難樣品：多糖多酚含量異常高的植物老根、成熟米粒、花粉、花蕾、種子、青稞、草莓果實、松樹、藻類、棉花組織、菌類，成分異常復雜的腫瘤組織。鑒于此類樣品提取方法不成熟，為免來回送樣影響研究進度，暫不接收RNA提取工作，請客戶自行提取。如果客戶堅持送樣，由客戶承擔責任和提取風險。

四、樣品儲存與運輸

樣品儲存 

    組織樣品儲存于液氮或超低溫冰箱中。RNA樣品儲存于超低溫冰箱中，在-20℃冰箱保存時間不宜太久。細胞樣品經(jīng)Trizol處理后儲存于超低溫冰箱中。在-20℃冰箱中儲存不宜太久。血液樣品分離白細胞后用Trizol處理，然后儲存于超低溫冰箱中。 

樣品運輸 ：樣品運輸建議采取液氮或干冰保存下的超低溫運輸。 

液氮運輸 

1、液氮運輸好在人員監(jiān)護下進行。長途應采用液氮罐，短途可采用保溫杯。應液氮足夠，以免運輸過程中液氮揮發(fā)掉，影響材料質(zhì)量。

2、液氮罐口較為狹小，所以放入的物品不易過大，以免無法取出。好將樣品放入編過號的凍存管中，再根據(jù)不同類別放入合適的小布袋，用線繩栓住，線繩另一端用布條做標記，拴在罐口提手上，以方便取出和分辨。 

3、凍存管應用進口高質(zhì)量的凍存管，放入液氮前應擰緊，以免取出時發(fā)生炸裂傷人。

干冰運輸 

    干冰運輸應采用壁厚且質(zhì)量完好的泡沫箱，材料用編號后的凍存管存放，用塑料袋包裝后埋入干冰中，泡沫箱應扣嚴并用封箱帶密封力求嚴密。外套紙箱包裝，以免碰裂。并標明輕取輕放提示，以**運輸。 

   干冰運輸可委托當?shù)乜爝f公司，注意要48小時送達，不能送貨上門的應提前通知。 ２４小時到達的，干冰數(shù)量不得低于５公斤；４８小時到達的，干冰數(shù)量不得低于８公斤。夏季可以適當再多增加部分干冰（平時的1.5倍）。

    如果干冰不能填滿泡沫盒子，可用泡沫或棉花填充，運輸時也可在干冰上再放一排液體冰帶。 

    運輸過程中應隨時跟蹤貨物的情況，記錄快遞單號，并保持與發(fā)出地和接收地的快遞公司的聯(lián)系。 

RNA運輸

    RNA運輸須經(jīng)乙醇(兩倍體積)或異丙醇(等體積)沉淀,沉淀后的ＲＮＡ，可以用低溫冰袋冰盒運輸，但時間也不易太久，以24小時為限。未經(jīng)沉淀的RNA應用干冰或液氮運輸。

細胞及血液運輸

    細胞短距離可３７度培養(yǎng)瓶（細胞培養(yǎng)液）運輸（24小時內(nèi)）。長途運輸可以Trizol處理后干冰運輸。

    血液當?shù)囟叹嚯x可以加入抗凝劑（或直接用抗凝管乘后）后冰塊運輸（2小時內(nèi)），長途運輸可先分離白細胞，Trizol處理后干冰運輸。

五、樣品接收程序 

1、客戶與公司簽訂委托服務合同并付預付款后，將符合要求的樣品（附樣品送樣單）直接或委托銷售人員送至本公司實驗中心。

2、實驗中心收到樣品后，立即登記。 

3、在接收樣品時，將檢查運輸包裝中液氮、干冰等量是否足以保持樣品穩(wěn)定、實際樣品數(shù)目與樣品送樣單中的記錄樣品數(shù)目是否相符、樣品登記單填寫是否完整。 

4、接收樣品后，將在規(guī)定的工作時間內(nèi)完成核酸提取而后送質(zhì)量部進行質(zhì)檢。質(zhì)量部質(zhì)檢后，將出具質(zhì)檢報告。在規(guī)定的工作日內(nèi)向客戶提供質(zhì)檢報告。 

5、質(zhì)檢合格的樣品，實驗中心在規(guī)定的工作日內(nèi)完成后續(xù)實驗。