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WB免疫印跡實驗步驟及需要注意什么？
western blot是在凝膠電泳和固相免疫測定技術(shù)基礎(chǔ)上發(fā)展起來的一種新的免疫生化技術(shù)。由于免疫印跡（western blot）具有
SDS-PAGE的高分辨力和固相免疫測定的高特異性和敏感性，現(xiàn)在已成為蛋白分選的一種常規(guī)技術(shù)。免疫印跡（western blot）常用
于鑒定某種蛋白，并能對蛋白進行定性和半定量分選。
western blot一般實驗步驟：蛋白質(zhì)抽提，蛋白質(zhì)定量，變性聚丙稀酰胺不連續(xù)凝膠電泳（SDS-PAGE），蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移，western blot膜的封閉和抗體孵育，western blot結(jié)果檢測，western blot數(shù)據(jù)分析，提供實驗報告。
免疫印跡實驗步驟及需要注意事項：
1、用0.01M PBS洗膜，5min ×3次。
2、加入包被液，平穩(wěn)搖動，室溫2hr。
3、棄包被液，用0.01M PBS洗膜，5min×3次。
4、加入一抗（按合適稀釋比例用0.01M PBS稀釋，液體覆蓋膜的全部），4℃ 放置12hr以上。陰性對照，以1%BSA取代一抗，其余步驟與實驗組相同。
5、棄一抗和1%BSA，用0.01M PBS分別洗膜，5min×4次。
6、加入辣根過氧化物酶偶聯(lián)的二抗（按合適稀釋比例用0.01M PBS稀釋），平穩(wěn)搖動，室溫2hr。
7、棄二抗，用0.01M PBS洗膜，5min×4次。
8、加入顯色液，避光顯色至出現(xiàn)條帶時放入雙蒸水中終止反應(yīng)。
需要注意事項：
1、一抗、二抗的稀釋度、作用時間和溫度對不同的蛋白要經(jīng)過預(yù)實驗確定佳條件。
2.上樣順序搞清楚，在一張膜上才能比較，分組太多的話，可以每樣選擇一個樣本即可。
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