可能有的童鞋對PCR不屑一顧,“啥？PCR？不就是Polymerase Chain Reaction,不就是聚合酶鏈式反應嘛,什么巢氏PCR、Q-PCR,哥都做過,so easy！”,其實PCR也有很多拓展應用,上面的幾個只是其中之一而已。

老生常談,也為了照顧一下可能對PCR只知道皮毛的童鞋,咱們從PCR的祖墳開始刨。

PCR能夠在體外進行DNA復制,微量的DNA經(jīng)過PCR擴增后,DNA片段的量將大幅增加。無論是化石中的古生物、歷史人物的殘骸,還是幾十年前兇殺案中兇手所**的毛發(fā)、皮膚或血液,只要能分離出一丁點的DNA,就能用PCR加以放大。這也是“微量證據(jù)”的威力之所在。

1)標準的PCR反應體系中應該包含：buffer反應液、DNA聚合酶、鎂鉀離子、4種脫氧核糖核酸(A、T、C、G)、1對引物、DNA片段模板。

2)反應條件：①加熱94℃,DNA模板解鏈②退火到45~55℃③72℃延伸。

原位PCR( in situ PCR)技術

原位PCR綜合了PCR 和原位雜交(Insitu hybridization,ISH) 的優(yōu)點,是一種在組織切片或細胞涂片上原位對特定的DNA或RNA進行擴增,再用特異性的探針原位雜交檢測。

細胞膜和核膜有一定的通透性,PCR擴增所需的各種成分可進入細胞內(nèi)或核內(nèi),在原位對特定的DNA或RNA進行擴增。擴增產(chǎn)物由于分子量較大或互相交織,不易透過細胞膜向外彌散,故保留在原位。

錨定PCR(Anchored PCR,APCR)技術

原理：用酶法在一通用引物反轉(zhuǎn)錄cDNA3’-末端加上一段已知序列,然后以此序列為引物結(jié)合位點對該cDNA進行擴增,稱為APCR。

應用：它可用于擴增未知或全知序列,如未知cDNA的制備及低豐度cDNA文庫的構(gòu)建。

不對稱PCR(asymmetric PCR)技術

兩種引物濃度比例相差較大的PCR技術稱不對稱PCR。在擴增循環(huán)中引入不同的引物濃度,常用50~100：1比例。在起初的10～15個循環(huán)中主要產(chǎn)物還是雙鏈DNA,但當?shù)蜐舛纫锉幌谋M后,高濃度引物介導的PCR反應就會產(chǎn)生大量單鏈DNA。

應用：可制備單鏈DNA片段用于序列分析或核酸雜交的探針。

反轉(zhuǎn)錄PCR(reverse transcription,RT- PCR)技術

當擴增模板為RNA時,需先通過反轉(zhuǎn)錄酶將其反轉(zhuǎn)錄為cDNA才能進行擴增。RT-PCR應用非常廣泛,無論是分子生物學還是臨床檢驗等都經(jīng)常采用。

巢式PCR(NEST PCR)技術

先用一對靶序列的外引物擴增以提高模板量,然后再用一對內(nèi)引物擴增以得到特異的PCR帶,此為巢式PCR。

等位基因特異性PCR(Allele- specificPCR,ASPCR)技術

ASPCR依賴于引物3’- 端的一個堿基錯配,不僅減少多聚酶的延伸效率,而且降低引物-模板復合物的熱穩(wěn)定性。

這樣有點突變的模板進行PCR擴增后檢測不到擴增產(chǎn)物,可用于檢測基因點突變。

復合PCR(multiplex PCR)技術

原理：在同一反應中用多組引物同時擴增幾種基因片段,如果基因的某一區(qū)段有缺失,則相應的電泳譜上這一區(qū)帶就會消失。

應用：復合PCR主要用于同一病原體的分型及同時檢測多種病原體、多個點突變的分子病的診斷。

重組PCR技術

重組PCR技術是在兩個PCR擴增體系中,兩對引物分別由其中之一在其5’-端和3’-端引物上帶上一段互補的序列,混合兩種PCR擴增產(chǎn)物,經(jīng)變性和復性,兩組PCR產(chǎn)物互補序列發(fā)生粘連,其中一條重組雜合鏈能在PCR條件下發(fā)生聚合延伸反應,產(chǎn)生一個包含兩個不同基因的雜合基因。

定量PCR(quantitative PCR,qPCR)技術

這個也是大家非常熟悉的方法了,qPCR可用于研究基因表達,能提供特定DNA基因表達水平的變化,在癌癥、代謝紊亂及自身**性**的診斷和分析中很有價值。

競爭性PCR(competitive PCR,c-PCR)技術

c-PCR技術是競爭cDNA模板與目的cDNA同時擴增,使用同樣的引物,但一經(jīng)擴增后,能從這些目的cDNA區(qū)別開來。通常使用突變性競爭cDNA模板,其序列與目的cDNA序列相同,不過模板中僅有一個新內(nèi)切位點或缺少內(nèi)切位點。

這種方法能測定mRNA中cDNA靶序列,可用于幾個到10個細胞中mRNA的定量。