材料：

1 PVDF膜為millipore公司,孔徑為0.45um.,

2 過(guò)硫酸銨等試劑購(gòu)自上海生工生物技術(shù)有限公司。

3 蛋白預(yù)染Marker購(gòu)自碧云天公司。

4 顯影粉，定影粉及X光膠片購(gòu)自上海冠龍。

5，RIPA緩沖液含50mM Tris (pH7.4)，150mM NaCl，1% NP-40，0.5% sodium deoxycholate，0.1% SDS，sodium orthovanadate，sodium fluoride，EDTA，leupeptin (碧云天公司)，用時(shí)添加PMSF，終濃度為1mM。

6，電泳緩沖液及丙烯酰胺（29：1）均購(gòu)自上海迪生生物技術(shù)有限公司。其它試劑購(gòu)自上海生工生物技術(shù)有限公司。

7，電泳儀，型號(hào) mini protean 3 cell. BIO－RAD 公司。

8, 電轉(zhuǎn)儀，PS-9，大連競(jìng)邁科技有限公司。

9，發(fā)光劑，ECL^TM western bloting detection.，購(gòu)自GE healthcare, 貨號(hào)RPN2106

目的蛋白抗體名稱

操作流程：

1 電泳：凝膠為12％聚丙烯酰胺凝膠電泳，蛋白的每孔的上樣量為40ug總蛋白。電壓100V， 15min；120V恒壓，1h 30min。

 2 轉(zhuǎn)膜：半干轉(zhuǎn)，1h30min。 電轉(zhuǎn)液為1L溶液含3.0g Tris，14.4g 甘氨酸，200ml 甲醇。

 3 洗膜：PBS，洗滌5min，一次。

 4 加一抗，稀釋液為含5％脫脂奶粉的PBST，稀釋1：400。4℃,一抗室溫孵育2h。

5 洗膜，PBST洗滌3次，每次5min。

6 加二抗，抗兔HRP二抗，稀釋液為含5％脫脂奶粉的PBST，稀釋1：5000，室溫?fù)u晃2h。

7 洗膜，PBST洗滌3次，每次5min。

8 發(fā)光： 加發(fā)光劑，X光膠片曝光，壓片約1min，顯影。 

β-actin（內(nèi)參蛋白）

操作流程：

 1 電泳：凝膠為12％聚丙烯酰胺凝膠電泳，漿蛋白的每孔的上樣量為40ug總蛋白。電壓100V， 15min；120V恒壓，1h 30min。

 2 轉(zhuǎn)膜：半干轉(zhuǎn)，1h30min。 電轉(zhuǎn)液為1L溶液含3.0g Tris，14.4g 甘氨酸，200ml 甲醇。

 3 洗膜：PBS，洗滌5min，一次。

 4 加一抗，β-actin（abcam），稀釋液為含5％脫脂奶粉的PBST，稀釋1：10000。4℃, 一抗室溫孵育2h。

5 洗膜，PBST洗滌3次，每次5min。

6 加二抗，抗鼠HRP二抗，稀釋液為含5％脫脂奶粉的PBST，稀釋1：5000，室溫?fù)u晃2h。

7 洗膜，PBST洗滌3次，每次5min。

8 發(fā)光： 加發(fā)光劑，X光膠片曝光，壓片約30s，顯影。

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