基因甲基化檢測

行為學檢查、原位癌模型、雙熒光素酶、基因甲基化、免疫組化、激光共聚焦、電鏡檢查

一. MSP實驗流程：

 1. 基因組抽提； 

 2. 基因組DNA定量； 

 3. 重亞硫酸鹽轉(zhuǎn)化（C轉(zhuǎn)化為U)，本步實驗至關(guān)重要，轉(zhuǎn)化效率高低直接影響實驗結(jié)果，所以，需要實驗者在實驗過程中不斷摸索合適的實驗條件以較高的轉(zhuǎn)化效率； 

 4. 引物設(shè)計（每個基因設(shè)計兩對引物，分別為：甲基化引物M，非基因化引物U，對應(yīng)擴增甲基化和非甲基化的目的片段），有時需設(shè)計巢式引物； 

 5. PCR擴增：對甲基化和非甲基化的目的片段分別擴增,此時盡可能使用梯度PCR儀，可以同時使用不同的退火溫度，以篩選合適的退火溫度； 

 6. PCR產(chǎn)物電泳； 

 7. 電泳結(jié)果分析（定性即有無甲基化，半定量即甲基化程度高低）。

二. qMSP實驗流程：  

1.基因組抽提；

2. 基因組DNA定量； 

3. 重亞硫酸鹽轉(zhuǎn)化（C轉(zhuǎn)化為U)，本步實驗至關(guān)重要，轉(zhuǎn)化效率高低直接影響實驗結(jié)果，所以，需要實驗者在實驗過程中不斷摸索合適的實驗條件以較高的轉(zhuǎn)化效率；  

4. 引物和探針設(shè)計（每個基因設(shè)計一對引物和兩條條探針），定量引物和探針的設(shè)計難度是比 較大的，設(shè)計好的引物和探針既需要理論上的分析驗證（軟件），又需要通過實驗驗證和篩選，所以一個目的基因有時需設(shè)計幾對不同引物和探針以供篩選； 

5. 標準品制備：  1. 非甲基化DNA的制備：篩選合適的基因組DNA，其沒有甲基化，作為陰性對照; 2. 甲基化DNA的制備：用甲基轉(zhuǎn)移酶對非甲基化的DNA進行甲基化修飾，目的是把 DNA中所有的CG中的C甲基化，修飾后的DNA是甲基化的，作為陽性對照; 3. 把A作為0%甲基化，B作為甲基化，對A和B進行不同比例的混合，形成梯度甲基化 的標準品;  4. 對C步的系列標準品進行Realtime PCR擴增，制備多個不同的標準曲線;  5. 根據(jù)標準曲線的相關(guān)系數(shù)，對D步的標準曲線進行篩選，選擇合適的標準曲線用于后續(xù)的實 驗.  

6. PCR擴增：對實驗樣本進行PCR擴增，此時盡可能使用梯度PCR儀，可以同時使用不同的退火溫度，以篩選合適的退火溫度.

7. Realtime PCR擴增：對實驗樣品進行定量PCR擴增，同時擴增標準曲線; 

8. 結(jié)果分析：通過PCR結(jié)果可以直觀的看出每個樣本的甲基化程度（百分比）。

三. BSP（亞硫酸鹽測序法）

實驗流程：  

1. 基因組抽提； 

2. 基因組DNA定量；  

3. 重亞硫酸鹽轉(zhuǎn)化（C轉(zhuǎn)化為U)，本步實驗至關(guān)重要，轉(zhuǎn)化效率高低直接影響實驗結(jié)果，所以， 需要實驗者在實驗過程中不斷摸索合適的實驗條件以較高的轉(zhuǎn)化效率；  

4. 引物設(shè)計（每個基因設(shè)計一對引物，引物位置盡可能的避開DNA中的CG位點），有時需設(shè) 計巢式引物；  

5. PCR擴增：對實驗樣本進行PCR擴增，此時盡可能使用梯度PCR儀，可以同時使用不同的退 火溫度，以篩選合適的退火溫度。 

6. PCR產(chǎn)物電泳；  

7. 對目的條帶進行切膠回收；  

8. 回收后的PCR產(chǎn)物連接克隆載體（T載體）； 

9. 轉(zhuǎn)化E.coli H5α； 

10. 挑選陽性克隆測序；  

11. 測序結(jié)果分析：實驗專業(yè)甲基化分析軟件對測序序列進行甲基化分析，可以得到如下數(shù)據(jù)：  

A. 測序序列與目的序列的相似度（%）； 

B. C-T轉(zhuǎn)化效率（%）；  

C. 目的片段中每個CG的甲基化情況（點狀圖）； 

D. 每個CG的甲基化率(%)； 

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