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免疫共沉淀(Co-IP)原理及步驟
免疫共沉淀(Co-IP)原理及步驟
免疫共沉淀(Co-IP)原理及步驟:實驗材料：蛋白質(zhì)
試劑、試劑盒：RIPA Buffer PBS Protein A agarose 瓊脂糖 還有考馬斯亮藍染色液
儀器、耗材： 離心機 搖床 EP管 細胞刮子 離心管 培養(yǎng)板 電泳儀 電泳槽 高效液相色譜儀
免疫共沉淀(Co-IP)原理及步驟：實驗步驟
一、試劑準備
1.預(yù)冷PBS，RIPA Buffer，細胞刮子（用保鮮膜包好后，埋冰下），離心機。
2.用預(yù)冷的PBS洗滌兩次細胞，終一次吸干PBS。
3.加入預(yù)冷的RIPA Buffer(1 ml/107個細胞、10 cm培養(yǎng)皿或150 cm2培養(yǎng)瓶，0.5 ml/5×106個細胞、6 cm培養(yǎng)皿、75 cm2培養(yǎng)瓶）。
4.用預(yù)冷的細胞刮子將細胞從培養(yǎng)皿或培養(yǎng)瓶上刮下，把懸液轉(zhuǎn)到1.5EP管中，4℃，緩慢晃動15 min（EP管插冰上，置水平搖床上）。
免疫共沉淀(Co-IP)原理及步驟其原理是：當細胞在不是變性條件下被裂解時，完整細胞內(nèi)存在的很多蛋白質(zhì)－蛋白質(zhì)間的相互作用被保存了下來。比如用蛋白質(zhì)X的抗體免疫沉淀X，那么與X在體內(nèi)結(jié)合的蛋白質(zhì)Y也能沉淀下來。多用精制的proreinA預(yù)先結(jié)合固化在argarose的beads上，使之與含有抗原的溶液及抗體反應(yīng)后，beads上的proreinA就能吸附抗原達到精制的目的。這種方法常用于測定兩種目標蛋白質(zhì)是否在體內(nèi)結(jié)合；也可用于確定一種特定蛋白質(zhì)的新的作用搭檔。
