冰凍切片的免疫組化染色步驟

1.速凍組織 將組織塊平放于軟塑料蓋或特制小盒內(nèi)（直徑2cm），如組織塊小可適當(dāng)?shù)募覱CT包埋劑浸沒組織，然后將特制小盒緩緩平放入盛有液氮的小杯內(nèi)，當(dāng)盒底部接觸液氮時(shí)就開始?xì)饣序v，此時(shí)小盒保持原位不要浸入液氮內(nèi)，大約10-20秒組織即立刻冰凍成塊。

2.切片 取出組織冰塊迅速置入-80℃冰箱留著備用，或置于恒冷切片機(jī)冰凍切片。冰凍切片4~8mm。

3.保存 冰凍切片后如不染色，吹干，儲(chǔ)存低溫冰箱內(nèi)，或進(jìn)行短暫預(yù)固定后儲(chǔ)存冰箱內(nèi)保存。

4.固定 室溫放置30分鐘后，入4℃丙酮固定10分鐘。也可根據(jù)需要選擇其它的固定方6.式。

5.沖洗 PBS洗，5分鐘×3。

6.內(nèi)源性過氧化物酶的阻斷 用3%過氧化氫孵育5~10分鐘，消除內(nèi)源性過氧化物酶的活性。

7.沖洗 PBS洗，5分鐘×3。

8.以下接石蠟切片免疫組化染色操作步驟（滴加一抗開始）。

附石蠟切片免疫組化染色步驟

三步法（以SP試劑盒為例）

1. 石蠟切片脫蠟至水。

2. 蒸餾水沖洗，PBS浸泡5分鐘，如需采用抗原修復(fù)，可在此步后進(jìn)行。

3.3%H2O2室溫孵育5~10分鐘，以消除內(nèi)源性過氧化物酶的活性，PBS沖洗，2分鐘×3次。

4. 5~10%正常山羊血清封閉，室溫孵育10分鐘。傾去血清，勿洗，滴加適當(dāng)比例稀釋的一抗或一抗工作液，37℃孵育1~2小時(shí)或4℃過夜。

5.PBS沖洗，2分鐘×3次。

6.滴加適當(dāng)比例稀釋的生物素標(biāo)記二抗（1%BSA-PBS稀釋），37℃孵育10~30分鐘；或滴加**代生物素標(biāo)記二抗工作液，37℃或室溫孵育10~20分鐘。

7. PBS沖洗，2分鐘×3次。

8.滴加適當(dāng)比例稀釋的辣根酶標(biāo)記鏈霉卵白素（PBS稀釋），37℃孵育10~30分鐘；或**代辣根酶標(biāo)記鏈霉卵白素工作液，37℃或室溫孵育10~20分鐘。

9.PBS沖洗，2分鐘×3次。

10. 顯色劑顯色（DAB或AEC）。

11.自來水充分沖洗，復(fù)染，脫水透明（如需要）、封片。

二步法（以PV-9000通用型二步法檢測試劑盒為例）

1. 石蠟切片脫蠟至水。

2.蒸餾水沖洗，PBS浸泡5分鐘，如需采用抗原修復(fù)，可在此步后進(jìn)行。

3.3% H2O2室溫孵育5~10分鐘，以消除內(nèi)源性過氧化物酶的活性，PBS沖洗，2分鐘×3次。

4.滴加適當(dāng)比例稀釋的一抗或一抗工作液，37℃孵育1~2小時(shí)或4℃過夜。

5.PBS沖洗，2分鐘×3次。

6. 滴加試劑1（Polymer Helper），室溫或37℃孵育20分鐘，PBS或TBS沖洗，2分鐘×3次。

7. 滴加試劑2（poly peroxidase-anti-mouse/rabbit IgG），室溫或37℃孵育20~30分鐘，PBS或TBS沖洗，2分鐘×3次。

8. PBS沖洗，2分鐘×3次。

9.顯色劑顯色（DAB或AEC）。

10自來水充分沖洗，復(fù)染，脫水透明（如需要）、封片。