Western Blot實(shí)驗(yàn)總結(jié)

1.緩沖液的選擇，是用PBS/PBST，還是用TBS/TBST？

（1）PBS/PBST不適合AP系列，TBS/TBST適合AP和HRP體系。

（2）另外,做磷酸化蛋白的WB，PBS不合適

2.如果用HRP體系，那么不能用疊氮鈉做防腐劑。因?yàn)榀B氮鈉會(huì)抑制HRP的作用。

3.WB中抗體的選擇：

單抗專一性高，但是經(jīng)過(guò)SDS－PAGE變性膠電泳的蛋白質(zhì)可能由于原來(lái)的識(shí)別位點(diǎn)構(gòu)象發(fā)生改變而不被識(shí)別。多抗不如單抗專一性高但更容易得到結(jié)果。

4.簡(jiǎn)易的WB——“不知道是否有表達(dá)，比如抗體少還要摸條件（稀釋度），可以用剪膜剩下的邊角料來(lái)先做幾組點(diǎn)雜交摸條件，省點(diǎn)時(shí)間省點(diǎn)試劑”

5.WB中Tween－20的作用：

吐溫是一種非離子型表面活性劑，可以洗掉一些非特異性結(jié)合的蛋白和抗體，降低背景。

6.ECL熒光淬滅的問(wèn)題：

二抗?jié)舛冗^(guò)高，HRP濃度過(guò)高，會(huì)超速催化底物生成產(chǎn)物使膜發(fā)黃。所以二抗?jié)舛忍土瞬恍校吡擞捎跁?huì)出現(xiàn)卒滅的現(xiàn)象也行不通。

（1）弱信號(hào)或者無(wú)信號(hào)：在HRP高的情況下，來(lái)不及壓片就已耗竭底物！解決辦法：加入底物后迅速進(jìn)入暗室，壓片10秒鐘！或者適當(dāng)降低2抗?jié)舛取?/span>

（2）反影(白色條帶,黑色背景) ：條帶處HRP很快將底物耗竭，則不發(fā)光，不使膠片感光而為白色,周?chē)虮尘癏RP較低而持續(xù)發(fā)光一段時(shí)間使膠片感光為黑色。解決方法同上。

（3）另外一種反影現(xiàn)象就是壓出條帶粗大模糊，但條帶中心是空的白色，原因和上面的一樣，主要是條帶中心耗竭底物引起的，也可以在暗室看到中空的熒光帶，但與上面的區(qū)別主要在于特異性要好一些，若繼續(xù)發(fā)展則就是弱信號(hào)或者無(wú)信號(hào)，解決方法同上。

7.western 背景深原因：

（1）封閉的不好。封閉試劑不合適等。

（2）洗滌不充分。洗滌液的量過(guò)低等。

（3）樣品濃度過(guò)高。

（4）抗體濃度（特別是二抗?jié)舛龋┻^(guò)高。

8.Western中的正反面問(wèn)題。

，PVDF膜本身是不區(qū)分正反面的，兩面都可以用。但是轉(zhuǎn)膜之后就分為與膠直接接觸的一面和不直接接觸的一面。有一種說(shuō)法認(rèn)為轉(zhuǎn)膜后，蛋白存在于與膠直接接觸的一面，因此，加ECL時(shí)要加在與膠直接接觸的那面上。

另一種說(shuō)法則認(rèn)為，轉(zhuǎn)膜后蛋白并不是簡(jiǎn)單的粘在膜上，而是嵌入膜中了，所以膜的兩面都有蛋白，ECL隨便加在哪一邊。個(gè)人同意**種說(shuō)話，但是由于轉(zhuǎn)膜的程度不同，兩面所含的蛋白量也可能不同。

9.在做Western Blot時(shí)，PVDF膜用甲醇浸泡的目的？

PVDF膜用甲醇泡的目的是為了活化PVDF膜上面的正電基團(tuán)，使它更容易跟帶負(fù)電的蛋白質(zhì)結(jié)合，做小分子的蛋白轉(zhuǎn)移時(shí)多加甲醇也是這個(gè)目的。

10.ECL是什么？

ECL（electronic ChemiLuminescence)是指一種方法、原理，是利用電解的氧化還原產(chǎn)物之間或與體系中某一組分進(jìn)行化學(xué)反應(yīng)而發(fā)光的一種分析法.Western-blotting 中指電化學(xué)發(fā)光免疫法。其原理：辣根過(guò)氧化酶使試劑中的發(fā)光物（Luminol）氧化并發(fā)光，而試劑中含有增強(qiáng)劑這使得發(fā)光增強(qiáng)了1000倍。Luminol發(fā)生氧化降解，并發(fā)射波長(zhǎng)為428nm的光，此光可經(jīng)X光片（放射自顯影片）感光記錄下來(lái)。