材料與方法

試劑：①化學(xué)試劑：碳酸氫鈉、磷酸氫二鈉、硫酸鎂、考馬斯亮蘭。②細胞培養(yǎng)試劑與培養(yǎng)板：F12培養(yǎng)液、胎牛血清、胰蛋白酶(寶泰克)、膠原酶Ⅰ、Ⅱ型、L-谷氨酰胺、二巰基乙醇、青霉素、鏈霉素、6孔、24孔、96孔培養(yǎng)板。

儀器：凝膠成像儀、數(shù)碼照相系統(tǒng)、二氧化碳培養(yǎng)箱、酶標儀、PCR擴增儀、超聲波清洗器、倒置顯微鏡、恒溫震蕩培養(yǎng)箱、CLP-800電泳儀、超高速冷凍離心機、梅特勒-托利多AB204-N單量程萬分之一電子天平、超小型電泳儀Mupid-2。

實驗材料：新西蘭大白兔。

動物模型及分組：雄性新西蘭白兔8只，3～5個月齡，體重2.5～3.5kg，平均2.85kg。隨機分兩組，每組4只。

手術(shù)方法：①實驗組：用20%烏拉坦(5ml/kg)靜脈麻醉，取髕內(nèi)側(cè)切口長約2cm，逐層切開軟組織，打開關(guān)節(jié)腔，將髕骨外翻，將雙膝關(guān)節(jié)內(nèi)側(cè)副韌帶、前后交叉韌帶切斷并切除內(nèi)側(cè)半月板，注意勿損傷關(guān)節(jié)軟骨；沖洗關(guān)節(jié)腔后，逐層縫合切口，術(shù)后應(yīng)用肌注青霉素40萬U/日，持續(xù)7天，術(shù)后不固定傷肢，每天驅(qū)趕兔奔跑2次，每次強迫其活動1小時，模型建立需8周。②對照組：實驗動物采用同樣的麻醉方法，只打開關(guān)節(jié)腔后，同樣將髕骨脫位，保持關(guān)節(jié)腔暴露時間大致同實驗組，其余處理同上。

取材鑒定：手術(shù)后 8 周空氣栓塞處死動物，無菌條件下取雙側(cè)膝關(guān)節(jié)標本。實驗組軟骨面色澤灰暗，表面粗糙糜爛，軟骨下骨外露，骨贅增生明顯，尤以脛骨內(nèi)側(cè)髁明顯。對照組軟骨表面光滑，色澤正常，未見軟骨表面裂紋及凹陷，無骨贅形成。

主要實驗試劑及藥物制備：①D-Hank's平衡鹽溶液：電子天平分別稱量NaCl 8.00g/L、KCl 0.40g/L、NaHPO4?H2O 0.06g/L、KH2PO4 0.06g/L、NaHCO3 0.35g/L、酚紅0.02g/L，加入去離子水溶解，攪拌均勻，加入青霉素20萬U/ml 500μl、鏈霉素20萬U/ml 500μl，定容至1000ml，濃鹽酸調(diào)節(jié)pH值至7.0，過濾**備用。②F12細胞培養(yǎng)液：電子天平分別稱量NaHCO3 2g、MgSO4 74.64mg/L、葡萄糖2g，加入F12干粉中，用去離子水溶解，加入青霉素20萬U/ml 500μl、鏈霉素20萬U/ml 500μl，攪拌均勻，定容至1000ml，濃鹽酸調(diào)節(jié)pH值至7.6，過濾**并以500ml/瓶分裝，按比例加入胎牛血清、2-ME及L-谷氨酰胺，4℃?zhèn)溆谩?/span>

軟骨細胞提取與培養(yǎng)：將手術(shù)收集的軟骨標本放入10ml無菌玻璃平皿，倒入D-Hank's液掩蓋標本；在另一平皿中，加入少量F12培養(yǎng)液，用手術(shù)刀切碎軟骨，使成1～2mm3的小塊；移入離心筒中，用F12培養(yǎng)液掩蓋，離心1000rpm 5分鐘；收集全部切碎軟骨，除去F12，加入8ml 1×透明質(zhì)酸酶，室溫下作用5分鐘；除去透明質(zhì)酸酶，另加入16ml透明質(zhì)酸酶，室溫下作用10分鐘；祛除透明質(zhì)酸酶，用F12清洗兩遍，每次10ml，離心1000rpm 5分鐘。用1×膠原酶4ml清洗5分鐘，祛除清洗液；加入8ml膠原酶，37℃培養(yǎng)30分鐘，離心600rpm 5分鐘；保留上清至無菌離心筒中；加入20ml膠原酶，37℃培養(yǎng)90分鐘繼續(xù)消化；視組織消化程度，一般消化至組織蓬松，呈絮狀；收集上清液，1000rpm離心8分鐘，獲得細胞團；棄上清，將細胞懸浮于16mlF12培養(yǎng)液中，200目過濾至新無菌離心筒中。10μl移液器取細胞懸液1μl，計數(shù)。按5×104接種于培養(yǎng)瓶中。37℃、5%CO2孵箱中培養(yǎng)。2～4日，F12培養(yǎng)液換液1次。

軟骨細胞生長曲線的測定：取生長狀態(tài)良好的細胞，制成細胞懸液。經(jīng)計數(shù)后，將細胞以1×10^4/ml接種于24孔板中；每隔1天取3個孔細胞進行計數(shù)，計算均值，培養(yǎng)2～4天給未計數(shù)的細胞換液；以培養(yǎng)時間為橫軸，細胞數(shù)為縱軸，將計數(shù)點連接成曲線。

結(jié)果與分析

骨性關(guān)節(jié)炎軟骨組織病理：顯微鏡下觀察，實驗組軟骨表面出現(xiàn)潰瘍，各層結(jié)構(gòu)界限消失，潮線紊亂乃至多重，軟骨細胞減少，但大量簇集。對照組軟骨表面光滑，層次清楚，軟骨細胞排列整齊，分布均勻，潮線清晰完整，軟骨細胞數(shù)量正常，無簇集。

軟骨細胞：骨性關(guān)節(jié)炎軟骨細胞與正常軟骨細胞形態(tài)相似，為貼壁細胞，呈多角形，偶可見梭形，原代細胞培養(yǎng)時軟骨細胞呈島狀生長；傳代軟骨細胞貼壁良好，細胞飽滿、透明，細胞多層生長時，可見細胞分泌胞外基質(zhì)。

正常、骨關(guān)節(jié)炎軟骨細胞生長曲線：傳代正常、骨性關(guān)節(jié)炎軟骨細胞近似“S”形，生長周期約在3周，經(jīng)過1周的潛伏期，軟骨細胞進入對數(shù)生長期，2周左右達到平臺期后穩(wěn)定生長，本實驗選用作圖法，即在細胞生長曲線的對數(shù)生長期找出細胞增加一倍所需時間。據(jù)觀察，骨性關(guān)節(jié)炎軟骨細胞生長周期較正常軟骨細胞生長周期短，且于傳代培養(yǎng)1～1.5周兩種軟骨細胞均處于對數(shù)生長期，適于進一步進行實驗研究。