細(xì)胞的復(fù)蘇

復(fù)蘇細(xì)胞與凍存的要求相反，應(yīng)采用快速融化的手段。這樣可以細(xì)胞外結(jié)晶在很短的時間內(nèi)即融化，避免由于緩慢融化使水分滲入細(xì)胞內(nèi)形成胞內(nèi)再結(jié)晶對細(xì)胞造成損害。

用品：

培養(yǎng)液，吸管，離心管，培養(yǎng)瓶，帶蓋搪瓷罐。

步驟：

（1）、從保存安瓿的小袋內(nèi)或支架上取出的安瓿應(yīng)直接投入 37℃ 溫水中，并不時搖動令其盡快融化。如果安瓿熔封不嚴(yán)，在保存過程中液氮進(jìn)入安瓿中，從液氮罐中取出時由于溫度升高導(dǎo)致液氮急速氣化而爆炸，使安瓿變得粉碎，飛濺的玻璃碎片可傷害面部等。因此，存取安瓿時都要佩戴眼鏡和手套，安瓿投入存放溫水的器皿中后應(yīng)立即把蓋子扣上，以防發(fā)生意外。

（2）、從 37℃水浴中取出安瓿，用酒精消毒后折斷頸部，用吸管吸出細(xì)胞懸液，注入離心管并滴加10倍以上培養(yǎng)液，混合后低速離心，除去上清液，再重復(fù)用培養(yǎng)液洗一次。

（3）、用培養(yǎng)液適當(dāng)稀釋后，接種培養(yǎng)瓶，放在37℃溫箱靜置培養(yǎng)，次日更換一次培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)。如果復(fù)蘇時細(xì)胞密度較高要及時傳代。

細(xì)胞復(fù)蘇時細(xì)胞數(shù)可以做10-20倍稀釋，接種密度以 5*10⁵/ml為宜。

注意事項(xiàng)：

1、取細(xì)胞的過程中注意帶好防凍手套，護(hù)目鏡。此項(xiàng)尤為重要，細(xì)胞凍存管可能漏入液氮，解凍時凍存管中的氣溫急劇上升，可導(dǎo)致爆炸。

2、凍存液的問題：凍存液的配置已是常識，在這里不做詳述，但是二甲基亞砜(DMSO)對細(xì)胞不是無毒副作用，在常溫下，二甲基亞砜對細(xì)胞的毒副作用較大，因此，在1-2min內(nèi)是凍存液融化。 如果復(fù)蘇溫度較慢，會造成細(xì)胞的損傷，二甲基亞砜(DMSO)好選擇進(jìn)口產(chǎn)品。

3、離心前須加入少量培養(yǎng)液。細(xì)胞解凍后二甲基亞砜濃度較高，注意加入少量培養(yǎng)液可稀釋其濃度，以減少對細(xì)胞的損傷。

4、離心問題：主要有兩種見解。一種是解凍后的細(xì)胞懸液直接吹打均勻后分裝到培養(yǎng)瓶中進(jìn)行培養(yǎng)，**天換液。因?yàn)殡x心的目的是兩個，去除DMSO，去除死細(xì)胞，這個是標(biāo)準(zhǔn)流程，但對一般來說，把握不好離心轉(zhuǎn)速時間，轉(zhuǎn)的不過活細(xì)胞沉底的少，細(xì)胞就全被扔掉了，轉(zhuǎn)過了活細(xì)胞會受壓較大，死亡。此外在操作過程中容易污染，所以不推薦。另一種說法為細(xì)胞懸液中含有二甲基亞砜（DMSO），DMSO對細(xì)胞有的毒副作用，所以須將離心后的液體前倒凈，且倒干凈。我在試驗(yàn)中按照常規(guī)的離心分裝的方法進(jìn)行復(fù)蘇，結(jié)果無有異常。

5、細(xì)胞貼壁少的問題：教科書中說明凍存細(xì)胞解凍時1ml細(xì)胞液要加10ml－15m培養(yǎng)液，而在我的試驗(yàn)中的經(jīng)驗(yàn)總結(jié)為培養(yǎng)基越少細(xì)胞越容易貼附

6、復(fù)蘇細(xì)胞分裝的問題：實(shí)驗(yàn)總結(jié)為復(fù)蘇1管細(xì)胞一般可分裝到1-2只培養(yǎng)瓶中，分裝過多，細(xì)胞濃度過低，不利于細(xì)胞的貼壁。

7、加培養(yǎng)基的量放入問題：這個量的多少的把握主要涉及到的問題是DMSO的濃度，從如果你加培養(yǎng)基的太少，那么DMSO的濃度就會比較大，就會影響細(xì)胞生長，從以前的資料來看，DMSO的濃度在小于0.5%的時候?qū)σ话慵?xì)胞沒有什么影響，還有一個說法是1％。所以如果你的凍存液的濃度是10％DMSO的話那么加10ml以上的培養(yǎng)基就恰好稀釋到了無害濃度。