端粒酶對染色體的穩(wěn)定性及決定細胞生命周期起極其重要的作用。端粒酶或末端轉(zhuǎn)移酶是由兩個主要的亞單位構(gòu)成：RNA成分（hTR）和蛋白質(zhì)分解亞單位（hTERT）,RNA（hTR）亞單位普遍表達于正常和腫瘤組織中，而蛋白質(zhì)分解亞單位（hTERT）僅在腫瘤細胞、生殖譜系細胞及激活的**細胞中表達。

實驗步驟     

材料

無菌

生長培養(yǎng)基：含高濃度葡萄糖（4.5 g/L）的 Dulbecco's modifiled Eagle's 培養(yǎng)液（DMEM），添加L-谷酰胺 2 mmol/L、10% 胎牛血清、100U/mL 青霉素及 100 μg/mL 鏈霉素

聚凝胺： 8 mg/mL

普通容器 ：培養(yǎng)瓶 25 cm2，75 cm2

反轉(zhuǎn)錄酶病毒載體的產(chǎn)生用材料

細胞系:

PG13

GP+E-86

反轉(zhuǎn)錄病毒載體 GCsam hTERT

轉(zhuǎn)染用 htrt DNA

Tx 緩沖液 ：總量 20 mL，含有以下物質(zhì)：

HEPES 0.5mol/L，pH 7.1   200μL

NaCl，5rnol/L   100μL

Na2 HPO4/NaH2PO4，1mol/L   3μL

UPW   1.7 mL

緩沖液 A：總量 20.04 mL，含有以下物質(zhì)：

NaCl（5mol/L）   600μL

EDTA（0.5mol/L）40μL

Tris-HCl，pH7.5（0.5mol/L）400μL

UPW   19 mL

hMSC（人間充質(zhì)干細胞）細胞的轉(zhuǎn)導用材料

hMSC（人間充質(zhì)干細胞）細胞

培養(yǎng)瓶 75 cm2

多孔板 6 孔

轉(zhuǎn)導后用材料

用于冷凍保存的實驗材料（見方案 20.1）

用于 DNA 指紋分析 (見方案 16.8) 或 DNA 圖譜分析（見方案 16.9）或其他驗證分析方法的實驗材料（如方案 16.10）

PCR 試劑

DNA 100 μg/mL

10×PCR 緩沖液 L（含 Mg2+）

正向引物（2μmol/L）

反義引物（2μmol/L）

dNTP 混合物（10 mmol/L）

DNA 聚合酶

UPW

操作步驟

反轉(zhuǎn)錄酶病毒載體的產(chǎn)生

具有 hTERT 基因的反轉(zhuǎn)錄酶病毒載體通過兩個步驟包裝進入長臂猿白血病病毒（GALV）包裝的細胞系PG13。，使用 20 μg/mL htrtDNA（Geron）轉(zhuǎn)染包裝細胞系 GP+E-86，然后用上清液感染 PG13細胞。

1. 6.7×105 GP+E-86 細胞系接種在一個小培養(yǎng)瓶（25 cm2）中。

2.GP+E-86 細胞系的轉(zhuǎn)染

（a）將 280μL Tx 緩沖液加人每個管中（常用容器）。

（b）制備 DNA 管

（c）將 Tx 緩沖液逐滴加人含有 DNA 溶液的管內(nèi)，輕輕地混合。

（d）在室溫下孵育 30℃，使其產(chǎn)生沉淀。

（e）在每個含有 GP-E-86 細胞的 25 cm2 培養(yǎng)瓶中，加入 5 mL 新鮮培養(yǎng)液。

（f）輕輕加入混合液（Tx+DNA）至 GP+E-86 細胞，在 37℃ 孵育 4-6 h。

（g）在 25 cm2 培養(yǎng)瓶內(nèi)，用 D-PBSA 小心地洗三次。

（h）加新鮮培養(yǎng)液至細胞中，在 37℃ 孵育隔夜。

3. 更換細胞培養(yǎng)液，加 2 mL 新鮮培養(yǎng)液 (取代以前 5 mL 培養(yǎng)液)，以產(chǎn)生病毒。

4. 在進行第三步的同**，將 1×104 個 PG13 細胞接種于 6 孔板的每個孔中。

5. 次日，從感染的 GP-E-86 細胞收獲其上清液，加入終濃度為 8 μg/mL 的多聚胺 (如 1 μg/mL 上清液)。

6. 用孔徑 0.45μm 濾膜過濾上清液，將 2 mL 過濾液加至含 GP-E-86 細胞的每個孔中。

7. 在 32℃ 1000 g 離心培養(yǎng)板。

8. 在 37℃ 孵育隔夜。

9. 次日，更換細胞的培養(yǎng)液。

hMSC 細胞的轉(zhuǎn)導

1. 將 2×106 PG13 細胞種人 75 cm2 培養(yǎng)瓶中。

2. 次日，將 6 mL 新鮮培養(yǎng)液加至 PG13 細胞中。

3. 第三日，將 hMSC 細胞（約 2.5×104~7.5×104 個）加至 6 孔板中，用于轉(zhuǎn)導。

4. 從包裝的細胞收獲上清液，加入終濃度為 8 μg/mL 的多聚胺，用孔徑 0.45μm 的濾膜過濾上清液。

5. 將2mL過濾后的反轉(zhuǎn)錄病毒上清液加入 6 孔板的每個孔中。

6. 在32℃ 1000 g 離心培養(yǎng)板，37℃ 孵育隔夜。

7. 吸去逆轉(zhuǎn)錄病毒上清液，加入新鮮培養(yǎng)基。

轉(zhuǎn)導后培養(yǎng)物的處理

1. 經(jīng)過10~12次傳代接種，未接受hTERT基因的細胞將死亡，剩余的細胞 則已插入hTERT基因，具有hTERT基因的細胞將在傳代過程中被選擇出來。

2. 建議將細胞分裝在安瓿中冷凍保存，建立一個轉(zhuǎn)導細胞的貯備庫，這些轉(zhuǎn)導細胞處于不同的群體倍增（PI）水平（可與 PD 生長曲線相匹配）。這樣做也可節(jié)省時間，因為如果發(fā)生污染就要丟棄培養(yǎng)的細胞，重新開始。

3. 在梅次傳代培養(yǎng)時，用下列公式獲得PD，以建立PD生長曲線。

公式中的PD代表種群倍增的次數(shù)，In 是自然對數(shù) Nstart 是細胞初始接種量，Nfinish 是細胞在傳代培養(yǎng)過程中所獲得的全部細胞數(shù)。

例 1，如果初種入2×105個細胞，培養(yǎng)后增加至3.2×106個細胞，則：

如果按 1:4 的細胞量進行傳代培養(yǎng)，則每次傳代培養(yǎng)后的 Nfinish 將乘以 4。所以在上述例子中，假設(shè)有 10 次傳代培養(yǎng)，Nfinish 就是（3.2×106）×4 的 10 倍，也就是 3.4×1012。

例 2，如果初種入2×105個細胞，培養(yǎng)后可增加至3.2×106個細胞。以1:4的細胞址傳代培養(yǎng)10次，則：

4. 在建立永生細胞系之后，檢查其真實性，以其來源于初的材料， 而不是由于交叉污染從實驗室其他永生細胞系衍生而來。這是能做到的，例如針對轉(zhuǎn)移基因（hTERT）的PCR 檢測、DNA 指紋檢 測或 DNA 圖譜檢測。

hTERT的PCR

1. 溶解PCR試劑并保存在冰塊中

2. 對下列試劑進行仔細的混合，記住，要包括陽性對照（其他hTERT陽性標本）和陰性對照（無DNA模板）

DNA1μL（100ng）100μg/mL

10×PCR緩沖液（含 Mg2+）2μL

正義引物   2μL

反義引物   2μL

dNTP 混合物（10 mmol/L）   0.4μL

DNA 多聚酶   0.1μL

UPW   12.5μL

終體積為 20 mL（包括 DNA）

3.將管子置于PCR儀器中，按以下步驟進行操作：90℃，3 min，進行變性作用；94℃，30s，再次進行變性作用；59℃，39s，進行復(fù)性；74℃，1 min，進行延伸；如此循環(huán)30個周期，然后是74℃，1 min。

4. 將PCR產(chǎn)物在1.5%~2%瓊脂糖凝膠中進行電泳。