膿毒癥相關(guān)性腦病在膿毒癥患者是一種常見并發(fā)癥，合并膿毒癥相關(guān)性腦病者病死率明顯增加。臨床對于膿毒癥相關(guān)性腦病仍是排除性診斷，缺乏客觀的診斷指標(biāo)，如生化指標(biāo)、影像學(xué)指標(biāo)、電生理學(xué)指標(biāo)等，導(dǎo)致流行病學(xué)及發(fā)生機(jī)制均不明確，因此確立相對客觀統(tǒng)一的診斷標(biāo)準(zhǔn)勢在必行。動物模型的選擇建立對其機(jī)制及**方法研究具有重要意義。研究人員應(yīng)用腦電圖和誘發(fā)電位監(jiān)測早期診斷膿毒癥相關(guān)性腦病，取得效果，但尚未形成統(tǒng)一結(jié)論。根據(jù)已有膿毒癥相關(guān)性腦病模型研究的進(jìn)展，選用盲腸結(jié)扎法（CLP）建立膿毒癥模型，通過監(jiān)測大鼠神經(jīng)行為學(xué)改變、腦電圖信號及體感誘發(fā)電位改變等來早期診斷膿毒癥相關(guān)性腦病，并對所建立的大鼠膿毒癥腦病動物模型進(jìn)行分析。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

清潔級成年雄性SD大鼠30只，體質(zhì)量200～250 g，由中南大學(xué)動物學(xué)部提供。

1.2 主要藥品、試劑、儀器

PBS購自鼎國生物工程公司，水合氯醛為中南大學(xué)湘雅醫(yī)院藥劑科化學(xué)分析室配制；多聚甲醛購置岳麓區(qū)鼎盛實驗器材公司；戊二醛、無水乙醇、二甲苯、蘇木素、伊紅、鋨酸等由中南大學(xué)病理教研室提供。套管針購置BD公司。腦立體定位儀，RM6240生物信號記錄器，Olympus BX41型光學(xué)顯微鏡（日本），LKB-Ⅲ型超薄切片機(jī)（瑞典），H-7500型透射電鏡（日本），石臘切片機(jī)（美國），生化培養(yǎng)箱（廣東），格蘭士微波爐 WP700，隔水式電熱恒溫培養(yǎng)箱（上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠），榮事達(dá)家用冷藏冰箱 BCD-202，MIAS醫(yī)用圖像分析管理系統(tǒng)電子攝像。

1.3 實驗方法

1.3.1 大鼠腦電及誘發(fā)電位監(jiān)測電極放置 30只大鼠稱質(zhì)量、編號分別在造模前10 d放置腦電監(jiān)測電極。水合氯醛腹腔注射麻醉后，大鼠頭部用立體定位儀固定，常規(guī)外科消毒，在頭顱中間矢狀位作3 cm的皮膚切口，將前囟點(diǎn)和其他顱骨縫暴露。在顱骨面行局麻（10%利多卡因噴霧），移去骨膜。用牙科鉆在頭顱鉆三個孔，將3根0.6 mm的不銹鋼螺絲輕輕置入直到到達(dá)腦功能定位處的硬腦膜：一個電極被安裝在軀體感覺皮質(zhì)處（記為S1電極）（前囟點(diǎn)后2.5 mm，右側(cè)矢狀縫旁開2.5 mm），剩余兩個電極被安裝在額竇上面（前囟點(diǎn)前10 mm，矢狀面?zhèn)冗?/span>1 mm），另外左側(cè)的電極用作接地電極。放置好電極后用牙托粉將電極固定在頭顱上，封閉骨孔，皮膚縫合。手術(shù)區(qū)域每6 h呋喃西林涂抹1次。

1.3.2 腦電活動評估 大鼠頭部用立體定位儀固定，利用固定于額部的S1電極記錄腦皮層電圖，對側(cè)的額竇電極作為信號地線。通過腦電圖機(jī)記錄信號，0.5～3 Hz （δ）， 4～8 Hz （θ）， 8～13 Hz （α）和13～30 Hz （β）頻帶。SEF95（低于95%能量的頻率）和MF中位頻率（中頻=低于50%功率的頻率）分析出來。同時記錄每只大鼠出現(xiàn)棘波的早時間。誘發(fā)電位監(jiān)測：兩個刺激電極固定在左側(cè)尾巴的中內(nèi)三分之一范圍內(nèi)，兩電極相隔2 mm。通過這兩個電極的刺激大鼠后，可以產(chǎn)生軀體誘發(fā)電位。刺激是2 ms的方形波脈沖，這些方形波脈沖由RM 6240產(chǎn)生。S1電極記錄軀體誘發(fā)電位。身體同側(cè)的額竇電極作為參考電極。對側(cè)的額竇電極作為信號地線。測量結(jié)果由兩個正電位（p1和p2）與一個負(fù)電極位（N1）組成。峰值基線和峰值潛伏期被估量出來。

1.3.3 動物模型制作及分組 10 d后，大鼠稱質(zhì)量、編號、隨機(jī)分組，術(shù)前禁食12 h。10%水合氯醛350 mg/kg腹腔注射麻醉，股靜脈置管開放靜脈通路，股動脈置管后連接RM6240生物信號記錄器，持續(xù)監(jiān)測血壓、心率。大鼠用盲腸結(jié)扎穿孔模型（CLP）方法誘發(fā)膿毒癥，常規(guī)消毒鋪巾，在大鼠側(cè)腹開2 cm的刀口，暴露出盲腸，然后在回盲腸連接處結(jié)扎。用22#注射針頭將盲腸刺穿兩次，輕輕擠壓盲腸使其內(nèi)的糞渣流進(jìn)腹膜。然后將盲腸送回腹腔，后關(guān)閉腹腔。假手術(shù)組的動物同樣開腹，除了結(jié)扎和穿刺操作外，盲腸也要被執(zhí)行其他同樣操作。所有手術(shù)動物皮下注射生理鹽水（3 ml/100 g），手術(shù)結(jié)束后切口用絡(luò)合碘消毒液清洗。術(shù)后每6 h需要用2%呋喃西林涂抹于手術(shù)區(qū)域。觀察大鼠神經(jīng)行為學(xué)改變，監(jiān)測CLP后4、6、8、12、24 h腦電圖，并記錄腦電波形改變及體感誘發(fā)電位數(shù)值。膿毒癥組大鼠按24 h內(nèi)有無腦電圖和誘發(fā)電位改變分為膿毒癥無腦病組和膿毒癥相關(guān)性腦病組。

1.3.4 膿毒性腦病大鼠的診斷標(biāo)準(zhǔn)及規(guī)定 參照Siami 等的研究，膿毒癥大鼠出現(xiàn)神經(jīng)行為學(xué)改變，同時腦電圖監(jiān)測出現(xiàn)δ波明顯增加，誘發(fā)電位P1振幅明顯降低，S-P1和N1-P1潛伏期明顯延長判定為出現(xiàn)膿毒癥相關(guān)性腦病。

1.4 觀察和檢測指標(biāo)

1.4.1 大鼠神經(jīng)行為學(xué)改變評價 評價大鼠耳廓反射、角膜反射、翻正反射、甩尾反射和逃避反射改變。耳廓反射通過輕觸外耳道引起頭部有力轉(zhuǎn)動為正常；角膜反射通過用棉簽輕觸大鼠角膜引起眨眼或頭部搖動為正常；翻正反射通過將大鼠仰臥位放置，觀察其是否能翻身成俯臥位，并前后腳放平。甩尾反射和逃避反射通過短暫刺激大鼠尾部引起躲避或轉(zhuǎn)頭逃避傷害刺激的反應(yīng)。0分為無反射，1分為反射減弱（10 s以內(nèi)缺乏反射），2分為正常反射。每只大鼠高評分為10分。

1.4.2 腦電圖及誘發(fā)電位改變 持續(xù)監(jiān)測大鼠從致傷開始后的腦電圖改變，并應(yīng)用RM6240生物信號記錄器分析0.5～3 Hz （δ）， 4～8 Hz （θ）， 8～13 Hz （α）和13～30 Hz （β） 頻帶比例。同時監(jiān)測大鼠呼吸頻率、心率、血壓變化。

1.4.3 灌注固定與腦組織取材行病理學(xué)及透射電鏡檢查 24 h后存活大鼠給予水合氯醛0.3～0.4 ml/100 g腹腔注射麻醉，將大鼠仰臥位固定于實驗臺上，剪開胸部，經(jīng)左心室插入細(xì)導(dǎo)管，繼續(xù)向上推進(jìn)直至導(dǎo)管進(jìn)入主動脈弓處，剪開右心耳。先以生理鹽水約200 ml灌注至流出液無色，肝臟變白后，繼以4%多聚甲醛150 ml灌注。灌注完畢后取腦組織，選取大腦額葉皮質(zhì)及海馬組織，一部分置于4%多聚甲醛中固定24 h，經(jīng)脫水、透明、浸蠟、包埋，制成4 μm厚的連續(xù)切片。另一部分置于2.5%戊二醛固定24 h以上，行透射電鏡檢測。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法

實驗數(shù)據(jù)采用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件在WindowsXP環(huán)境下處理，所有數(shù)據(jù)均進(jìn)行正態(tài)性檢驗和方差齊性檢驗。所有計量資料結(jié)果均采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，均數(shù)間兩兩比較采用SNK-q檢驗（Student-Newman-Keula，S-N-K法），計數(shù)資料采用χ2檢驗， P<0.05差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 一般情況及膿毒癥相關(guān)性腦病發(fā)生率

CLP大鼠出現(xiàn)蜷縮少動、豎毛和呼吸急促（>自身對照值2倍）表現(xiàn)。心率由正常的（358.2±8.8）次/min升至（453.3±12.9） 次/min，平均動脈血壓由正的（107.60±3.85） mm Hg （1 mm Hg=0.133 kPa）降至（60.71±4.23） mm Hg。30只大鼠（假手術(shù)組5只，CLP組25只）24 h內(nèi)死亡12只，13只膿毒癥大鼠進(jìn)行了后續(xù)研究及統(tǒng)計，24 h內(nèi)6只大鼠出現(xiàn)神經(jīng)行為學(xué)、腦電圖及誘發(fā)電位改變，確定為膿毒癥相關(guān)性腦病，其發(fā)病率為46%。

2.2 神經(jīng)行為學(xué)、腦電圖及體感誘發(fā)電位改變

假手術(shù)組大鼠神經(jīng)生物學(xué)評分基本正常，24 h時膿毒癥無腦病組及膿毒癥相關(guān)性腦病組神經(jīng)生物學(xué)評分明顯下降（P<0.05），但膿毒癥無腦病組與膿毒癥相關(guān)性腦病組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。膿毒癥相關(guān)性腦病組24 h 時α波較假手術(shù)組和膿毒癥無腦病組明顯下降，δ波增加（P<0.05），膿毒癥無腦病組與假手術(shù)組相比差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。與假手術(shù)組及膿毒癥無腦病組相比，膿毒癥相關(guān)性腦病組24 h時P1振幅下降，S-P1和N1-P2潛伏期延長（P<0.05），P1-N1無明顯改變（P>0.05）；而膿毒癥無腦病組與假手術(shù)組差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。膿毒癥相關(guān)性腦病組內(nèi)神經(jīng)生物學(xué)評分、腦電圖改變及體感誘發(fā)電位改變在術(shù)后6 h開始出現(xiàn)，24 h時與術(shù)前相比差異具有統(tǒng)計學(xué)意義，表現(xiàn)為神經(jīng)生物學(xué)評分下降，α波降低，δ波增加，P1振幅下降，S-P1和N1-P2潛伏期明顯延長（P<0.05）。

2.3 膿毒癥相關(guān)性腦病大鼠的病理形態(tài)學(xué)檢查結(jié)果

光鏡下可見假手術(shù)組大鼠神經(jīng)元及膠質(zhì)細(xì)胞大小正常，形態(tài)清晰，錐體細(xì)胞突起明顯，細(xì)胞結(jié)構(gòu)清晰；膿毒癥無腦病組大鼠24 h后可見部分神經(jīng)元及膠質(zhì)細(xì)胞形態(tài)改變，細(xì)胞結(jié)構(gòu)不清晰，但無明顯神經(jīng)元固縮及血管改變；膿毒癥相關(guān)腦病組大鼠可見明顯神經(jīng)元固縮、深染，細(xì)胞結(jié)構(gòu)不清，細(xì)胞周圍空隙明顯增大，膠質(zhì)細(xì)胞周圍間隙擴(kuò)大，空泡樣改變，血管周圍間隙擴(kuò)大。

 2.4 透射電鏡超微病理檢查結(jié)果

透射電鏡結(jié)果顯示，假手術(shù)組大鼠海馬和額葉區(qū)神經(jīng)元形態(tài)完整，結(jié)構(gòu)清晰，核膜完整，核形態(tài)正常，胞質(zhì)中細(xì)胞器豐富；線粒體形態(tài)正常，呈圓形或橢圓形，嵴較多而清晰可見。膿毒癥無腦病組大鼠海馬和額葉皮質(zhì)均見輕度神經(jīng)元水腫，核形態(tài)基本正常，核膜尚完整，染色質(zhì)均勻分布，細(xì)胞器豐富；胞質(zhì)內(nèi)有豐富的線粒體，大多數(shù)線粒體嵴完整，排列緊密規(guī)律，基質(zhì)顆粒極少量脫落。膿毒癥相關(guān)性腦病組大鼠額葉皮質(zhì)神經(jīng)元嚴(yán)重水腫，形態(tài)改變，細(xì)胞核不規(guī)則，核膜皺縮，胞質(zhì)高度水腫，細(xì)胞器數(shù)量明顯減少；線粒體呈氣球樣腫脹，大量空泡化，嵴斷裂、溶解、消失，同時伴有線粒體致密化改變，而海馬區(qū)亦見類似改變，程度較皮質(zhì)區(qū)稍輕。

3 討論

膿毒癥致病因素多種多樣，不同的因素導(dǎo)致了發(fā)病機(jī)制差別甚大，因此不同的動物模型得出的實驗結(jié)論也可能不同。Hubband等指出理想的動物模型應(yīng)具備以下標(biāo)準(zhǔn)：膿毒癥存在毒血癥，血培養(yǎng)陽性，動物表現(xiàn)出特征性代謝及生理紊亂，膿毒癥感染超過時間才使動物產(chǎn)生相應(yīng)反應(yīng)；同時該動物模型制作成本小，重復(fù)性好。湯耀卿和李磊提出膿毒癥動物模型都具有膿毒癥典型的高排低阻血流動力學(xué)表現(xiàn)和高代謝狀態(tài)；伴發(fā)多個器官功能障礙，出現(xiàn)器官功能障礙及動物死亡距膿毒癥模型制備應(yīng)有的時間間距；有較高的自然病死率，根據(jù)膿毒癥的轉(zhuǎn)歸， 要求動物模型的自然病死率達(dá)到50%～70%。不同模型有不同的優(yōu)缺點(diǎn)，而在臨床上膿毒癥常見同樣也難**的是腹腔感染，因此腹腔內(nèi)感染模型是常用的膿毒癥模型。腹腔內(nèi)感染法可將膿毒癥血流動力學(xué)和生化反應(yīng)成功復(fù)制，尤其是CLP堪稱為“金標(biāo)準(zhǔn)”。因此在本實驗中，筆者選擇了盲腸結(jié)扎法制作膿毒癥動物模型。在進(jìn)行盲腸結(jié)扎后大鼠出現(xiàn)蜷縮少動、豎毛、呼吸急促、心率增快、血壓下降表現(xiàn)。25只CLP 24 h內(nèi)死亡12只，病死率達(dá)到48%， 基本符合膿毒癥標(biāo)準(zhǔn)。

膿毒癥相關(guān)性腦病在臨床上主要表現(xiàn)為精神狀態(tài)的急劇惡化，如認(rèn)知障礙、意識混亂、定向障礙、激動、木僵或昏迷。研究認(rèn)為其與腦組織的缺血缺氧及腦細(xì)胞代謝障礙相關(guān)，但其機(jī)制非常復(fù)雜尚不明確。膿毒癥發(fā)生時，同時會伴有肝腎衰竭、急性呼吸窘迫綜合征、電解質(zhì)紊亂、酸堿失衡、 血糖異常、低血壓、低氧血癥、低溫、發(fā)熱或***異常等，且應(yīng)用**藥、機(jī)械通氣或神經(jīng)肌肉阻滯藥等**措施比較普遍，這些均使神經(jīng)系統(tǒng)本身病變的癥狀和體征容易被掩蓋，而臨床判斷SAE大多還是根據(jù)其癥狀和體征，并沒有客觀輔助檢查的診斷標(biāo)準(zhǔn)，于是確立和早期診斷膿毒癥相關(guān)性腦病尤為重要，腦電活動的改變可能成為重要的評價標(biāo)準(zhǔn)。有研究認(rèn)為，SAE可以根據(jù)患者的意識狀態(tài)，認(rèn)知功能的改變評估和腦電圖記錄的腦電活動來診斷。腦電圖改變程度與臨床嚴(yán)重程度的相關(guān)性因素可以表現(xiàn)為從慢頻波的增加到額外的三相波出現(xiàn)甚至嚴(yán)重情況下的突發(fā)抑制。動物實驗研究報道，對LPS模型的膿毒癥大鼠進(jìn)行腦電圖監(jiān)測，發(fā)現(xiàn)在全身血流動力學(xué)沒有顯著改變情況下，α波明顯下降，被認(rèn)為是腦部局部血流減少的跡象，對早期發(fā)現(xiàn)腦部低灌注可能有重要意義。在一項應(yīng)用盲腸結(jié)扎法制作膿毒癥大鼠模型監(jiān)測腦電圖改變研究中，發(fā)現(xiàn)24 h內(nèi)大鼠的整體腦電波形和α波幅度都有可識別的降低，可是與對照組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義。但研究分析中指出差異無統(tǒng)計學(xué)意義可能由于監(jiān)測時間過短導(dǎo)致，該研究同時發(fā)現(xiàn)24 h監(jiān)測過程中，50%的大鼠出現(xiàn)δ波顯著增加，在假手術(shù)和非手術(shù)的對照組中沒有觀察到類似的δ波改變，所以這些大鼠δ波增加不是手術(shù)與麻醉的影響，而是受盲腸結(jié)扎穿刺引發(fā)的炎癥反應(yīng)影響，導(dǎo)致腦病發(fā)生。因此δ波增加可能可以作為SAE模型中腦功能障礙發(fā)展的早期指標(biāo)。

體感誘發(fā)電位（SEP）測試是一種非侵入性調(diào)查神經(jīng)系統(tǒng)針對刺激的功能和檢測從周邊到中樞神經(jīng)系統(tǒng)體感通路的完整性的方法。當(dāng)感官檢驗是模棱兩可的時候，誘發(fā)電位所提供的功能障礙的客觀示范是非常有用的。SEP的記錄已經(jīng)被提出可以用作估計膿毒癥患者腦病的嚴(yán)重程度的技術(shù)。在胰腺炎誘發(fā)豬膿毒癥和LPS誘發(fā)大鼠膿毒癥的模型中，都已證實SEP記錄的改變可能是膿毒癥進(jìn)展的一個早期指標(biāo)的假設(shè)。在膿毒癥模型基礎(chǔ)上通過監(jiān)測腦電圖和體感誘發(fā)電位改變制作膿毒癥相關(guān)性腦病模型取得進(jìn)展。

研究結(jié)果顯示，在整個24 h監(jiān)測過程中部分CLP大鼠出現(xiàn)神經(jīng)功能改變，而腦電圖監(jiān)測6 h即有大鼠出現(xiàn)α波明顯下降，δ波增加，12 h變化部分顯著，同時伴有體感誘發(fā)電位變化，誘發(fā)電位P1振幅明顯降低，S-P1和N1-P1潛伏期明顯延長，在病理改變上可發(fā)現(xiàn)伴有神經(jīng)評分改變，腦電圖改變及體感誘發(fā)電位變化的大鼠出現(xiàn)明顯神經(jīng)元固縮、深染，細(xì)胞結(jié)構(gòu)不清，細(xì)胞周圍空隙明顯增大，膠質(zhì)細(xì)胞周圍間隙擴(kuò)大，空泡樣改變，血管周圍間隙擴(kuò)大。同時超微透射電鏡提示存在神經(jīng)元嚴(yán)重水腫，形態(tài)改變，細(xì)胞核不規(guī)則，核膜皺縮，胞質(zhì)高度水腫，細(xì)胞器數(shù)量明顯減少。線粒體呈氣球樣腫脹，大量空泡化，嵴斷裂、溶解、消失，同時伴有線粒體致密化改變，可早期診斷膿毒癥相關(guān)性腦病。而膿毒癥無腦病組盡管有少數(shù)大鼠也出現(xiàn)神經(jīng)生物學(xué)評分變化，但其腦電圖和體感誘發(fā)電位無明顯改變，同時其病理改變上僅見部分神經(jīng)元及膠質(zhì)細(xì)胞形態(tài)改變，細(xì)胞結(jié)構(gòu)不清晰，但無明顯神經(jīng)元固縮及血管改變；透射電鏡結(jié)果顯示，海馬和額葉皮質(zhì)均見輕度神經(jīng)元水腫，核形態(tài)基本正常，核膜尚完整，染色質(zhì)均勻分布，細(xì)胞器豐富。胞質(zhì)內(nèi)有豐富的線粒體，大多數(shù)線粒體嵴完整、排列緊密規(guī)律，基質(zhì)顆粒極少量脫落。腦部損害明顯輕于同時存在腦電圖和體感誘發(fā)電位改變組。

總之，對CLP大鼠24 h的研究中，24 h內(nèi)15只大鼠中7只大鼠出現(xiàn)神經(jīng)行為學(xué)、腦電圖及誘發(fā)電位改變，同時病理及電鏡超微結(jié)構(gòu)改變提示出現(xiàn)明顯神經(jīng)元損傷，線粒體結(jié)構(gòu)損傷及凋亡改變，確定為膿毒癥相關(guān)性腦病，其發(fā)病率為46%。因此通過對CLP膿毒癥大鼠模型進(jìn)行神經(jīng)生物學(xué)評價，腦電監(jiān)測及體感誘發(fā)電位監(jiān)測可早期發(fā)現(xiàn)膿毒癥相關(guān)性腦病，可成功建立膿毒癥相關(guān)性腦病模型，為后續(xù)膿毒癥相關(guān)性腦病機(jī)制研究打好基礎(chǔ)。