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反向PCR實驗
nverse-PCR是克隆插入片段側(cè)翼序列非常有效的方法。通常采用的Tail-PCR假陽性太多，而Inverse-PCR一般只要有特異條帶，基本上就是目的片段。
基本步驟如下：
1、反向PCR（Inverse PCR）原理：反向PCR是克隆T-DNA插入位點側(cè)翼DNA序列非常有效的方法。
a. 選擇合適的限制性內(nèi)切酶位點。并在T-DNA的邊界（左邊界、右邊界均可）和酶切位點附近設(shè)計引物P1、P2；
b. 回收DNA，T4連接酶連接，使酶切后的DNA片段環(huán)化；
c. 回收連接后的DNA，用引物P1、P2做PCR，就可擴增到兩端為T-DNA插入序列，中間為側(cè)翼序列的片段。
2、限制性內(nèi)切酶消化：選擇合適的限制性內(nèi)切酶，基因組要切成彌散性的條帶。在酶切之前，應(yīng)對基因組DNA定量。
根據(jù)T-DNA的左邊界序列選擇合適的酶切位點EcoRI，BamHI和HindIII/PstI，并在酶切位點上游附近設(shè)計引物Z1，Z2，Z3和Z4，然后用這些內(nèi)切酶分別消化基因組DNA， 37度 過一夜，電泳檢測酶切效果。
3、回收DNA
① 將酶切產(chǎn)物轉(zhuǎn)到1.5ml離心管中，用ddH2O洗滌干凈，并稀釋到250μl；
② 加入等體積的酚和氯仿（V：V=1：1），渦旋混勻，室溫靜置1min；
③ 大速度（13,
000 rpm）離心1min；
④ 將上清移到另一管中，加入等體積的氯仿，渦旋混勻，室溫靜置1min；
⑤ 大速度（13, 000 rpm）離心2min；
