一、什么時候需要穩(wěn)定細胞株？

以下實驗中，構(gòu)建穩(wěn)定細胞株而不是瞬時轉(zhuǎn)染更能滿足實驗要求：

1、外源片段在分裂細胞中長期(>2周)穩(wěn)定表達。雖然普通轉(zhuǎn)染實驗一般只能2-4天的轉(zhuǎn)染和表達效率，但腺病毒載體在多數(shù)分裂細胞中可以維持2-4周內(nèi)的高轉(zhuǎn)染效率和表達周期。而非分裂細胞，可以使用腺相關(guān)病毒載體轉(zhuǎn)導(dǎo)外源基因，因為腺相關(guān)病毒載體在許多非分裂細胞中可以保持長達1年的高效表達。

2、需要構(gòu)建使用誘導(dǎo)表達系統(tǒng)，這主要是由于：a)，過表達基因或者干擾目的基因引起細胞毒性或者抑制細胞生長等不利因素;

3、目的基因的過表達或者干擾需要時空特異性。

4、希望控制目的基因過表達或者干擾的拷貝數(shù)，以避免引入人為因素影響實驗結(jié)果的性。構(gòu)建穩(wěn)定株可以幫助篩選拷貝數(shù)適量的細胞進行實驗研究。

5、部分細胞種類，病毒載體亦無法達到高轉(zhuǎn)導(dǎo)效率，通過構(gòu)建穩(wěn)定株，達到外源片段的高效表達。

6、長期在少數(shù)幾類細胞中研究幾個基因的功能，通過構(gòu)建穩(wěn)定株，可以大大降低頻繁轉(zhuǎn)染或者病毒包裝的成本，也方便實驗研究。

7、部分蛋白穩(wěn)定性極強，瞬時RNA干擾因為作用周期短，只能抑制目的基因的表達，但無法去除已經(jīng)表達的目的蛋白，所以需要通過構(gòu)建穩(wěn)定株實現(xiàn)更好的基因干擾效果。

8、需要往動物體內(nèi)注射表達有外源片段的細胞。需要構(gòu)建穩(wěn)定細胞株，以防止注射入動物體內(nèi)后，很快外源片段表達丟失。

9、細胞個體差異(同一類細胞，不同個體細胞基因組存在差異)對實驗結(jié)果有干擾，需要構(gòu)建單克隆細胞株去除干擾。

10、需要將外源片段插入基因組中，比如基因敲除，基因插入突變篩選等修飾基因組的實驗。

二、什么時候不需要構(gòu)建穩(wěn)定株？

1、希望迅速觀察目的基因過表達或者干擾效果。例如在正式實驗之前進行的小規(guī)模預(yù)實驗。

2、2-4天的瞬時表達已經(jīng)可以達到具體的實驗?zāi)康?，比如檢測兩個外源轉(zhuǎn)染的目的蛋白之間的相互作用，或者觀察某些細胞周期抑制，凋亡或細胞存活相關(guān)基因的細胞表型。

3、細胞個體差異對實驗結(jié)果有影響。體外培養(yǎng)非原代細胞，多為轉(zhuǎn)化細胞系或者癌細胞，細胞個體差異大，瞬時轉(zhuǎn)染或者使用腺病毒/腺相關(guān)病毒載體進行轉(zhuǎn)導(dǎo)更可以反映細胞群體行為。或者使用逆轉(zhuǎn)錄病毒載體構(gòu)建混合穩(wěn)定株。

三、 病毒載體構(gòu)建穩(wěn)定細胞株有什么優(yōu)勢？

化學(xué)試劑介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染方法和電轉(zhuǎn)，整合率低，同時整合位點不穩(wěn)定，易發(fā)生再次丟失的情況，而且整合位點一般都在轉(zhuǎn)錄活躍區(qū)之外，所以并不是理想的穩(wěn)定整合工具。另外，整合后的拷貝數(shù)是由核內(nèi)的外源DNA局部濃度，而不是轉(zhuǎn)染時的DNA的量決定，而化學(xué)方法在輸入質(zhì)粒載體入核的效率比電轉(zhuǎn)和病毒載體相比要低得多，導(dǎo)致其轉(zhuǎn)染相同細胞所用質(zhì)粒載體用量要大大高于其它方法，造成入核質(zhì)粒載體量難以控制，這也解釋了為什么化學(xué)轉(zhuǎn)染方法和其它兩種方法比，更傾向于得到串聯(lián)多拷貝。以上種種因素，導(dǎo)致使用非病毒載體轉(zhuǎn)染方法構(gòu)建穩(wěn)定株，成功率低，穩(wěn)定性差，穩(wěn)定克隆株易出現(xiàn)不均一(含有非整合細胞)等缺點。

逆轉(zhuǎn)錄病毒載體由于整合率高，是非常理想的穩(wěn)定株構(gòu)建工具(表1)。而且通過控制逆轉(zhuǎn)錄病毒載體轉(zhuǎn)導(dǎo)的實驗條件，理論上可以每個細胞只有單拷貝插入。同時由于病毒載體是通過病毒重組酶將外源片段整合入染色體中，其整合特性和病毒自身整合特性非常相似：偏向于轉(zhuǎn)錄活躍區(qū)段，且整合后非常穩(wěn)定，在傳代100次后仍然保留在宿主基因組中。重要的是整合幾率和所有其它化學(xué)，物理轉(zhuǎn)染方法比，增加5至6個數(shù)量，使得穩(wěn)定株構(gòu)建不再成為實驗研究的障礙。由于整合幾率非常高，所以很容易獲得混合穩(wěn)定株。