1. 準(zhǔn)備工作

俗話說(shuō)用欲善其事，必先利其器。我強(qiáng)烈建議大家在做構(gòu)建之前先找好工具，這樣起的效果事半功倍。這里推薦大家兩個(gè)工具，一個(gè)都知道，PRIMER5.0。另一個(gè)工具極強(qiáng)大，叫l(wèi)asergene，包括設(shè)計(jì)引物到構(gòu)建圖譜一應(yīng)俱全，圖譜非常漂亮，而且分析酶切位點(diǎn)等等就超NB。

2. PCR
如果沒(méi)有現(xiàn)成的質(zhì)粒可供酶切，PCR是理想也是方便的策略。

PCR產(chǎn)物的純化
如果帶很單一，又強(qiáng)，直接PCR產(chǎn)物純化就可以，如果有雜帶，但目的帶也很強(qiáng)，跑膠，目的帶切膠回收?；厥者@里也有個(gè)瓶頸，就是回收率的問(wèn)題，我試過(guò)很多家的KIT，promega的GEL回收試劑盒效率和價(jià)格都很合適，推薦這個(gè)。
關(guān)于T載體，我在國(guó)內(nèi)的時(shí)候是必用的，到了美帝反倒一次沒(méi)用過(guò)，這邊比較流行直接用PCR產(chǎn)物切，就是回收完了直接切上，回收后然后連接，這又回到了開(kāi)始設(shè)計(jì)，要加保護(hù)堿基。這個(gè)策略好處就是免除了T載體這步，直接插入目的載體，存在的問(wèn)題就是處于盲做狀態(tài)，還要加保護(hù)堿基。
3. 酶切
我的原則一向是：盡量避免PCR，能酶切的多酶切，實(shí)在沒(méi)辦法才去PCR。
這里強(qiáng)烈推薦NEB的內(nèi)切酶，還記得在有一次用別家的酶切過(guò)夜，結(jié)果質(zhì)粒都被切碎了（當(dāng)然當(dāng)時(shí)質(zhì)粒濃度也不高），而用NEB的酶，切個(gè)七十二小時(shí)仍舊一切OK，尤其現(xiàn)在NEB還推出了HF的內(nèi)切酶，沒(méi)有星活性而且統(tǒng)一都用Buffer4，很好用，在國(guó)內(nèi)我都用TAKARA的酶，基本上還可以。
注意要讀說(shuō)明書(shū)，選用什么buffer，多少度，用不用加BSA，這些都要仔細(xì)讀。
酶切的起始量，PCR產(chǎn)物沒(méi)甚么可說(shuō)的，全都切上，如果是從質(zhì)粒上切片段，要根據(jù)你片段大小，片段適中，比如說(shuō)7kb質(zhì)粒，有2KB是目的片段，這時(shí)切個(gè)3-4ug就足夠了，如果只有0.2KB,那好多切點(diǎn)，6ug-7ug　內(nèi)切酶也沒(méi)問(wèn)題。
4. 連接
常用的是NEB的T4和Promega的T4,都很好用，但是注意Buffer里有ATP，反復(fù)凍融ATP失活得很快，這時(shí)有兩種辦法，一種是象我們chair實(shí)驗(yàn)室，每次連接都統(tǒng)統(tǒng)朝里面加1uL ATP;另一種是我們實(shí)驗(yàn)室的策略，拿到buffer就分裝，10uL/管，一次性使用，哪怕就用1uL，剩下的直接扔掉。連接重要的注意事項(xiàng)，1，載體總量，2.載體和插入片段比例，3.載體和插入片段質(zhì)量。
5. 轉(zhuǎn)化
這個(gè)簡(jiǎn)單遵循基本的準(zhǔn)則就行，話說(shuō)實(shí)驗(yàn)室原來(lái)從sigma買感受態(tài)（competent cell），后來(lái)發(fā)現(xiàn)還是自己做的效率高，尤其在使用XL-10**的時(shí)比DH5a效率要高，需要的話我可以發(fā)protocol上來(lái)。要注意的是LB無(wú)菌而且沒(méi)有***，實(shí)驗(yàn)室原來(lái)有個(gè)volunteer，做一次失敗一次，我就奇怪了，后來(lái)才發(fā)現(xiàn)他用的居然是加了KANA的LB，直接暈過(guò)去了。還有就是氯化鈣的問(wèn)題。氯化鈣吸水性很強(qiáng)，吸水后就完蛋了，我一般把它放在干燥罐里（反正我也不知道啥名字，就那種玻璃罐，干燥用的），大家要不放心，用之前可以把氯化鈣放在烘箱里烤一烤。
6. 鑒定
普通實(shí)驗(yàn)做酶切鑒定，陽(yáng)性率非常高，大多數(shù)情況下四個(gè)中起碼有三個(gè)是正確的，很多時(shí)候都是***正確，這里推薦一種叫fast digest的酶，切個(gè)十幾分鐘跑膠就行了。
如果找不到合適的酶切位點(diǎn)或者有其他問(wèn)題，比方說(shuō)有段時(shí)間我做個(gè)非常新潮的實(shí)驗(yàn)，初始步驟的雖然是藍(lán)白篩選，但是白斑也大部分都不對(duì)，沒(méi)辦法鑒定就用菌液PCR，夸張的一次是五十個(gè)白斑里面居然就一個(gè)陽(yáng)性的（沒(méi)辦法，該實(shí)驗(yàn)特點(diǎn)），這要提質(zhì)粒可提不起。菌液PCR也有講究，很多人做菌液PCR鑒定假陽(yáng)性特多，為甚么？因?yàn)槟鉖CR引物選的都在載體上，注意，引物分別在載體和插入片段上才準(zhǔn)，PCR方法鑒定是極其準(zhǔn)確的。

7. 測(cè)序
我們拿到測(cè)序結(jié)果時(shí)候，不僅要核對(duì)具體的序列，而且要看測(cè)序圖，這很重要，因?yàn)橛袝r(shí)候光看結(jié)果對(duì)，實(shí)際上圖顯示的不對(duì)，或者雖然結(jié)果不對(duì)，但是圖上出現(xiàn)的峰值本身就很怪異不可信，出現(xiàn)突變也不怕，有很大可能性是簡(jiǎn)并密碼子，還要重點(diǎn)檢查的地方就是“接頭”的地方，因?yàn)榕紶栆飼?huì)出錯(cuò)，比方說(shuō)少個(gè)堿基什么的，還有時(shí)候酶切之后連接也會(huì)丟一或者倆堿基什么的（這些問(wèn)題我都碰到過(guò)），如果不仔細(xì)檢查到了后期悔之無(wú)及。