一、熒光定量PCR基本原理及實驗?zāi)康?o:p>

熒光定量PCR通過對PCR擴增反應(yīng)中每一個循環(huán)產(chǎn)物熒光信號的實時檢測從而對起始模板定量及定性的分析。

實時熒光定量PCR的化學(xué)原理包括探針類和非探針類兩種，探針類是利用與靶序列特異雜交的探針來指示擴增產(chǎn)物的增加，非探針類則是利用熒光染料或者特殊設(shè)計的引物來指示擴增的增加。前者由于增加了探針的識別步驟，特異性更高，但后者則簡便易行。

由于SYBR Green I可結(jié)合所有的雙鏈DNA，因此不必因模板的不同而特別定制，且價格相對較低。然而，擴增產(chǎn)物的特異性是準確定量所必需的。通過分析擴增產(chǎn)物的熔點曲線可以判斷是否存在非特異性擴增，并進一步調(diào)整引物濃度或設(shè)計新的引物序列來避免非特異性擴增產(chǎn)物。

二、熒光定量PCR試劑配制

已有很多商品化的PCR反應(yīng)試劑（Master Mix）,包括dNTP、Mg2+、Taq酶、SYBR Green I染料和ROX染料（用來校正加樣誤差）、這些Master Mix往往被制成2倍濃縮液，實驗者用時只需加入總反應(yīng)體積一半的Master Mix液，然后加入引物和模板即可。

PCR反應(yīng)所需的試劑均須用無RNase和DNased的水稀釋。

三、熒光定量PCR實驗步驟

    1. 引物的設(shè)計與合成

（1）相關(guān)文獻檢索 可檢索所需檢測基因的相關(guān)文獻，查看是否已有公開發(fā)表的針對目的基因的用于定量PCR反應(yīng)的擴增引物序列和反應(yīng)條件。

（2）網(wǎng)站查詢 如無文獻提供，則查看以下三個網(wǎng)站是否有已經(jīng)證實的適用于定量PCR的擴增引物，探針以及反應(yīng)條件。

http://medgen.ugent.be/rtprimerdb

http://pga.mgh.harvard.edu/primerbank/index.html

http://www.realtimeprimers.org

（3）自己設(shè)計 如果沒有合適的或者已經(jīng)證實的可以提供參考，以下的設(shè)計原則可供參考：

①上下游引物的長度一般為18-30bp之間，且Tm值在58℃-62℃之間，上下游引物的Tm值相差盡量不超過2℃。

②引物中GC含量在30%-80%。應(yīng)避免引物中多個重復(fù)的堿基出現(xiàn)。引物的3'端盡量不為G或（和）C。引物3'端的5個堿基不應(yīng)出現(xiàn)2個G或（和）C。

③避免引物內(nèi)出現(xiàn)反向重復(fù)序列形成發(fā)夾二級結(jié)構(gòu)，同時也應(yīng)避免引物間配對形成引物二聚體。

④跨外顯子設(shè)計引物，用于區(qū)別或消除DNA的擴增。

    2. 提取組織或細胞的RNA 具體操作步驟同前。為了擴增效率，使定量結(jié)果更準確可靠，用于定量PCR的RNA要求有更高的純度，A260/A280的比值要在1.8-2.0之間。

    3. 將提取的RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA 反轉(zhuǎn)錄步驟同前。

    4. PCR條件的優(yōu)化 衡量所用反應(yīng)條件是否適合，主要是通過查看擴增曲線和反應(yīng)產(chǎn)物的特異性來確定。擴增曲線呈典型的S型擴增，且曲線平滑，說明模板狀況良好。是否有引物二聚體等非特異性擴增可通過融解曲線和瓊脂糖凝膠電泳來確定，融解曲線只呈現(xiàn)一個峰則說明擴增產(chǎn)物為特異性的。此外，下列參數(shù)的優(yōu)化有利于找到合適的反應(yīng)條件：

①模板的濃度：如果是進行次實驗，實驗者應(yīng)通過選擇一系列稀釋濃度的模板來進行實驗，以選擇出合適的模板濃度。一般而言，使所擴增的曲線進入指數(shù)擴增的循環(huán)數(shù)介于15-30個循環(huán)，若大于30，則應(yīng)使用較高的模板濃度，如小于15，則應(yīng)選擇較低的模板濃度。

②引物的濃度：引物的濃度是一個影響PCR反應(yīng)的關(guān)鍵因素，若濃度太低，會致使反應(yīng)不；若引物太多，則發(fā)生錯配以及產(chǎn)生非特異性的產(chǎn)物的可能性會大大增加。對于大多數(shù)PCR反應(yīng)，0.3umol/L是個合適的濃度，若選用這個濃度不理想，可在0.1-1.0umol/L之間進行選擇。此外，上下游引物的濃度也可根據(jù)需要調(diào)整，不相同。

③退火溫度：次實驗設(shè)置的退火溫度應(yīng)比計算得出的Tm值小5℃，然后在1℃-2℃內(nèi)進行選擇。一般的，退火溫度要根據(jù)經(jīng)驗來確定，這個經(jīng)驗值往往會同計算得到的Tm值有的差距。

    5. PCR反應(yīng)體系的制備 反應(yīng)體系通常為25ul:

2×SYBR Master Mix:12.5ul

引物：100-1000nmol/L

cDNA:10-50ng

補水至25ul

將針對同一基因的除模板外的擴增試劑混合，然后等量加入每個反應(yīng)管中，針對每個基因的每個樣品要有三個重復(fù)擴增管，然后向每管加入稀釋好的模板。

    6. 實時檢測和定量擴增的產(chǎn)物 將加樣后的96孔板用透明貼膜密閉，放入PCR儀中，設(shè)置好反應(yīng)條件，進行擴增。

四、結(jié)果分析

基因表達調(diào)控研究中，常用的相對定量方法主要有兩種，Delta-deltaCt法和雙標準曲線法。這兩種方法都至少要做兩個基因，目的基因和一個看家基因，以校正RNA純化后得率不同，RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA的效率不同等客觀因素。常用的看家基因有beta-actin(β-肌動蛋白)、GAPDH、18SrRNA等。因此，我們分別來看看以上兩種相對定量分析方法的特點和應(yīng)用。

    1. 相對雙Delta Ct法（Comparative Delta-delta Ct法）公式：2-△△Ct。由Delta-delta Ct的公式可以看出，該方法直接利用看家基因來校正樣品初始量，但同時默認兩個基因擴增效率一致。

Comparative Delta-delta Ct法的特點、注意事項及實際應(yīng)用：

①Comparative Delta-delta Ct法的一大特點是，當(dāng)優(yōu)化的體系已經(jīng)建立后，在每次實驗中無須再對看家基因和目的基因做標準曲線，而只需對待測樣品分別進行PCR擴增即可。

②每次實驗都默認目的基因和看家基因的擴增效率一致，而并非真實擴增情況的反映，因此實驗條件需要嚴格優(yōu)化，并且總會存在的偏差。

用Comparative Delta-delta Ct法展開定量實驗前，在預(yù)實驗中，對目的基因和看家基因做兩組標準曲線。如果兩組標準曲線斜率的差小于0.1，表明兩個基因的擴增效率已非常接近，那么后續(xù)實驗中就可以用Comparative Delta-delta Ct法進行相對定量分析。反之，差值大于0.1，就無法用該方法進行相對定量分析。此時的解決方法有兩種，一是優(yōu)化實驗，使兩組標準曲線的斜率差值小于0.1，二是換用其他的相對定量方法。

    2. 雙標準曲線法 雙標準曲線法考慮到了不同基因擴增效率的差異，用標準曲線來校正擴增效率。

雙標準曲線法的特點，注意事項及實際應(yīng)用：

①雙標準曲線法做相對定量分析的特點是，應(yīng)用簡便，無須像Comparative Delta-delta Ct法那樣對實驗進行嚴格的優(yōu)化。

②其不足之處是每次實驗都對目的基因和看家基因做兩組標準曲線。

并且，如果用于做標準曲線的標準品不同于樣品，比如標準品為質(zhì)?；蚣兓?/span>PCR產(chǎn)物，而待測樣品為cDNA,那么標準曲線的擴增效率并不能真實地反映樣品的擴增情況，因此以標準曲線來計算樣品的實際濃度就存在誤差。

每種相對定量方法都會有的局限性，對于雙標準曲線法，比較適合于樣本量不大、但研究的基因較多的客戶，這樣對不同基因條件優(yōu)化相對Delta-delta Ct法更為簡單。

五、熒光定量PCR注意事項

    1. 在制備反應(yīng)液的過程中操作者要戴手套，以避免污染。在用貼膜密閉96孔板時，由于定量PCR儀對熒光信號的采集是通過96孔板上面來進行的，因此用污染的手套或直接用手指接觸96孔板上面，都可能產(chǎn)生非特異性熒光信號，干擾后續(xù)的分析工作。

    2. 使用的加樣槍須經(jīng)過校準。

    3. 減少小體積操作。

    4. 將反應(yīng)液加入到檢測用的反應(yīng)孔板中時，避免產(chǎn)生氣泡。

    5. 防止試劑交叉污染，特別是模板與其他反應(yīng)用的液體應(yīng)隔離儲存。

    6. 引物和模板長期應(yīng)置于-20℃保存，防止降解。

    7. 含有SYBR Green I和ROX等染料的反應(yīng)混合液應(yīng)避光保存。