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質(zhì)粒提取
一、基本原理及實驗?zāi)康?/span>
質(zhì)粒提取實驗的目的是獲得較純凈的DNA質(zhì)粒。常用的方法有堿裂解法和煮沸法，其中堿裂解法是常用的小量制備質(zhì)粒DNA的方法。
二、主要儀器及試劑
高速離心機(jī)，質(zhì)粒提取試劑盒（Bioflux）。
三、質(zhì)粒提取操作步驟（以Bioflux公司的試劑盒為例）
1、將1ml過夜培養(yǎng)的菌液倒入離心管中，室溫12000r/min，離心1min。
2、棄培養(yǎng)液，使**沉淀盡可能干燥。
3、加入預(yù)冷的I液250ul,渦旋振蕩使細(xì)胞重新懸浮。
4、往懸浮液中加入II液250ul,蓋緊管口，溫和上下顛倒4-6次，獲得澄清的裂解液。
5、往上述混合液中加入III液350ul，蓋緊管口，溫和上下顛倒4-6次，直至形成白色絮狀沉淀。室溫13000r/min,離心15-20min。
6、小心吸取上清液，沒有沉淀吸出，轉(zhuǎn)移至收集柱中。室溫12000r/min，離心1min。
7、棄去離心甩出液，加入700ulDNA洗滌緩沖液洗滌柱子，室溫12000r/min，離心1min。
8、重復(fù)操作步驟7，棄去甩出液。
9、空離心，室溫12000r/min，離心1min。
10、把柱子置于一個干凈的1.5ml離心管中，加入TE緩沖液50-100ul到柱子上，靜置2min。
11、室溫12000r/min，離心1min，以洗脫出DNA?？蛇x重復(fù)操作進(jìn)行**次洗脫。
12、提取的質(zhì)粒可于4℃短期保存，并可于-70℃或-20℃長期保存。
四、結(jié)果判讀
質(zhì)粒本質(zhì)是雙鏈DNA，其質(zhì)量和純度可以用紫外分光光度計定量，高質(zhì)量的質(zhì)粒定量結(jié)果OD260/OD280在1.8左右，越接近1.8越好，若比值明顯低于1.8可能存在蛋白或提取試劑污染，明顯高于1.8可能存在RNA污染，OD260值在0.1-1.0之間，OD260/OD280的讀數(shù)才可信。質(zhì)粒濃度=OD260值×50×稀釋倍數(shù)/1000。
五、注意事項
1、過夜培養(yǎng)后，收集的**量要足夠，以提取質(zhì)粒的濃度。
2、加入I液后，渦旋振蕩要充分，以**裂解。
3、吸取上清液沒有沉淀，寧可少吸取一些液體。
4、空離心十分必要不能忽略。
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