一、基本原理及實驗?zāi)康?/span>

細(xì)胞凍存是通過向培養(yǎng)液中加入保護劑，減少凍存過程中細(xì)胞內(nèi)冰晶形成，來保護細(xì)胞，是保存細(xì)胞的基本方法。

二、主要儀器及試劑

1、0.25%胰蛋白酶：稱取胰蛋白酶粉末0.25g，加入100ml PBS，充分溶解后過濾**備用，4℃保存。

2、含20%胎牛血清的培養(yǎng)液：將培養(yǎng)液和胎牛血清按4:1比例混合，過濾**備用，4℃保存。

3、細(xì)胞凍存液：含20%胎牛血清的培養(yǎng)液和DMSO按照9:1比例混合，備用。

4、彎頭滴管、移液器及槍頭、凍存管等。

三、操作步驟（以貼壁生長的細(xì)胞為例）

1、取對數(shù)生長期的細(xì)胞，當(dāng)細(xì)胞增殖至培養(yǎng)瓶底（25cm²培養(yǎng)瓶為例）80%時，用彎頭滴管吸出培養(yǎng)基。

2、加入1ml胰蛋白酶，洗滌1次后棄去瓶中液體。

3、重新加入1ml胰酶，消化細(xì)胞。

4、倒置顯微鏡下觀察，當(dāng)細(xì)胞變圓并有部分細(xì)胞脫壁后，加入1ml含有血清的培養(yǎng)基終止消化。

5、用滴管吸取瓶中液體輕輕吹打培養(yǎng)瓶底，使細(xì)胞脫壁。

6、將細(xì)胞懸液移入離心管，800rpm離心5min。

7、棄去離心管中液體，加入培養(yǎng)基2ml，用滴管輕輕吹打，使細(xì)胞重懸。

8、800rpm離心5min。

9、用滴管吸去離心管中液體。

10、加入1ml細(xì)胞凍存液，重懸細(xì)胞。

11、將細(xì)胞懸液移入凍存管中，4℃放置30min。

12、-20℃放置2h，-70℃過夜。

13、放入液氮中保存。

四、結(jié)果判讀

判斷細(xì)胞凍存的好壞，需要看復(fù)蘇后，細(xì)胞的貼壁率及細(xì)胞狀態(tài)。若復(fù)蘇后細(xì)胞95%以上貼壁，而且細(xì)胞狀態(tài)良好，這就說明細(xì)胞凍存的過程沒有問題。

五、注意事項

1、所有的細(xì)胞實驗中均需要注意無菌操作。

2、細(xì)胞凍存的過程，降溫的速率要小。過快地降溫，會因細(xì)胞內(nèi)形成冰晶而使細(xì)胞死亡。

3、凍存的細(xì)胞要做好名稱和日期等標(biāo)記。

六、實驗心得

在細(xì)胞凍存前，要觀察細(xì)胞的狀態(tài)，細(xì)胞狀態(tài)的好壞直接決定了復(fù)蘇后細(xì)胞的生長情況。在凍存的前**需要給細(xì)胞換液，細(xì)胞凍存前有足夠的營養(yǎng)，以保持很好的細(xì)胞增殖狀態(tài)。對于增殖比較旺盛的細(xì)胞，在凍存時可以用相對較小的濃度，一般情況下，長滿一個25cm²培養(yǎng)瓶的細(xì)胞凍存一支就夠了。對于增殖比較緩慢的細(xì)胞，一般長滿兩個25cm²培養(yǎng)瓶的細(xì)胞凍存一支。

對于一些原代細(xì)胞來說（如某些正常細(xì)胞），凍存的效果可能不會太好。在實驗的過程中我們發(fā)現(xiàn)，配制凍存液的時候，用含10%胎牛血清的培養(yǎng)液或者含20%胎牛血清的培養(yǎng)液或者純血清，好像對細(xì)胞的影響并不是很大，但是如果DMSO的濃度高于10%，將會對細(xì)胞產(chǎn)生很大的毒性。如果細(xì)胞只是短期內(nèi)不用（3個月以內(nèi)），將細(xì)胞凍存在-70℃冰箱中即可；若長期不用，建議還是將其保存在液氮中。對于懸浮生長的細(xì)胞，省去胰酶消化環(huán)節(jié)，直接收集細(xì)胞懸液，離心即可。另外，操作細(xì)胞前，建議將培養(yǎng)基和胰酶平衡到室溫或37℃，以減小對細(xì)胞的影響。

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