一、抗體雜交實驗目的及原理

  利用抗原、抗體特異結合作用使結合于膜上的目的蛋白被一抗、二抗特異性標記。

二、抗體雜交實驗試劑及器材

  結合有蛋白質分子的NC膜或PVDF膜，一抗及二抗，去離子水，1%麗春紅染劑，Tween-20，Tris堿，Nacl,脫脂奶粉，剪刀，6cm平皿，平頭鑷子，移液器，封口機，避光盒，塑料袋。

三、抗體雜交實驗步驟

1、配制TBST緩沖液，配方附后。

2、將轉膜夾子從轉膜裝置中取出，打開，用平頭鑷子將NC膜或PVDF膜移入裝有1%麗春紅的平皿中，染色30s或更長時間，此時應看到膜上有整齊的粉紅色蛋白條帶，蛋白Marker泳道只有標定分子量的蛋白條帶，用圓珠筆標記Marker泳道的蛋白條帶，剪去多余的部分。

3、將標記好Marker、剪裁好的膜移入裝有TBST緩沖液的平皿中，搖床設定為80rpm，洗去染在膜上的麗春紅，洗滌期間適時更換TBST緩沖液。洗約5-10min。

4、用TBST配制含5%脫脂奶粉的封閉緩沖液40ml,將洗去麗春紅的膜移入裝有封閉緩沖液的平皿，搖床設定為60rpm，室溫條件封閉1h。

5、使用TBST配制適當稀釋度的一抗封閉緩沖液，將經過脫脂奶粉封閉的膜置入一合適大小的干凈的塑料袋中，加入配好的一抗緩沖液，封口機封口，搖床設定為60rpm，室溫條件封閉1h。采用封口機封口時注意塑料袋在橫軸和縱軸方向上壓膜封口時皺褶程度不同，盡量將NC膜長軸與皺褶程度小的方向擺放一致，壓膜的電壓適當選擇好，壓膜時間要在封口機紅燈熄滅后再壓5-6s開啟，可以減少皺褶及滲漏機會。這些雖然是細節(jié)，但是掌握不好卻可以影響整個實驗效果。

6、裝有膜的塑料袋保持平整地放置于4℃冰箱中，使NC膜各處均有一抗接觸，放置過夜。

7、從冰箱中取出裝有膜的塑料袋，剪開口，用平頭鑷子將膜取出，置于裝有TBST的平皿中，洗滌，搖床設定為80rpm，洗3-4次，每次5-10min。

8、使用TBST配制適當稀釋度的辣根過氧化酶標記的二抗封閉緩沖液，將洗過的膜置入一合適大小的干凈的塑料袋中，加入配好的二抗緩沖液，封口機封口，搖床設定為60rpm，室溫條件封閉1h。

9、接7，亦可選用熒光素標記的二抗，同樣使用TBST配制適當稀釋度的二抗封閉緩沖液。此時應將二抗封閉緩沖液裝入可以遮光的盒子，以避免熒光淬滅。將膜置于盒子中，搖床設定為60rpm，室溫條件封閉1h。

10、接8，將二抗封閉后的塑料袋剪開口，用平頭鑷子將膜取出，置于裝有TBST的平皿中，洗滌，搖床設定為80rpm，洗3-4次，每次5-10min。留待發(fā)光檢測。

11、接9，將膜仍置于遮光的盒子中，用TBST洗滌，搖床設定為80rpm，洗3-4次，每次5-10min。留待儀器掃描。

四、結果分析

  抗體封閉好壞直接關系到后續(xù)的結果，封閉良好時可獲得清晰、特異的結果，否則將得到模糊、雜亂、高背景的結果。

五、注意事項

1、配制TBST緩沖液時，要認真調節(jié)pH值，緩沖液pH值范圍為7.4-7.6。

2、注意標記膜上的Marker條帶及膜的上下角，記清每一個標記所代表的蛋白分子量大小，分清膜的前后面及上下左右。標有Marker一面為正面。

3、封閉緩沖液也可使用牛血清白蛋白配制，除非牛血清白蛋白中含有目的蛋白。

4、剛在脫脂奶粉中封閉完的膜先在TBST緩沖液中泡一下再封閉一抗。

5、確定封有膜的塑料袋沒有滲漏，否則極可能后沒有結果。

6、膜在封閉抗體時保持平整，避免外界因素造成蛋白結合抗體不均勻。

7、使用熒光二抗時要避光操作，并注意熒光二抗的保存期限，一般4℃可保存2周。

六、個人心得

1、可預先配制10×TBS，使用時稀釋至1×TBS，并加入相應量的Tween-20。

2、麗春紅染色后，膜上沒有著色或著色很淡：檢查1%麗春紅是否使用過久，可重新配制1%麗春紅再染色；轉膜失敗，轉膜時某一步電極接反；轉膜失敗，轉移緩沖液成分有問題，如甘氨酸質量過低。

3、麗春紅染色后，膜上可見圓圈狀白斑：組裝轉膜夾子時氣泡沒有趕出。若圓圈位于目的蛋白所在，則轉膜失敗。

4、麗春紅染色后發(fā)現(xiàn)蛋白條帶之間距離過近：電泳時蛋白沒有充分分離，可能為下層膠濃度過低或配制下層膠的Tris-HCl沒有按規(guī)定調節(jié)pH值。

5、脫脂牛奶封閉時，注意所用奶粉充分溶解成乳濁液。過期奶粉在溶液中呈顆粒狀，不能用于封閉。

6、抗體可以回收使用，加入疊氮鈉后保存時間可延長，推薦重復使用次數(shù)不超過3次，效果特別好的內參照蛋白抗體例外。

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