我時常說，養(yǎng)細胞就跟養(yǎng)孩子一樣，不，我養(yǎng)孩子都不會這么用心的！次接過屬于自己的細胞，那心情激動的，就跟捧著什么寶貝一樣，剛復蘇的時候恨不得一個小時看一次狀態(tài)，**換一次液，看到一兩個死細胞就想用PBS給它們清洗一下。。。。。?？上攵毎麜鞘裁垂順幼樱苑窒硪恍?strong>養(yǎng)細胞以來的經(jīng)驗教訓，歡迎各位一起討論。

1、到底應該怎么樣復蘇細胞，才能細胞成活率高？

  我們常用的方法是準備一個37℃水浴鍋、手套、鑷子。戴上手套，用鑷子夾住液氮罐中拿出的凍存管，然后在37-42℃水浴鍋里融解細胞，這種條件下復蘇的細胞，**天觀察不能復活，但是70%-80%復活是沒問題的。我想大部分同學都是用的這種復蘇細胞的方法，但是發(fā)現(xiàn)，其實正確的復蘇細胞的方法是：37度快速復蘇是正確的，但由于DMSO的存在，直接在37℃下復蘇細胞，會因為滲透壓劇烈變化而使細胞“原地爆炸”。所以更好的做法是解凍到零度時（凍存管里還有一點冰）轉移細胞至培養(yǎng)瓶或離心管中，然后用5ml熱培養(yǎng)基以0.5ml的加入量逐步將細胞內的DMSO滲透出來，之后就可以補全剩余的培養(yǎng)基到細胞瓶里了。

  細胞復蘇成活率低的原因可能有以下幾種：a 培養(yǎng)基或血清質量差，b 復蘇后立馬離心，導致大量細胞炸成碎片，c 細胞長時間放置在-80℃，d 傻乎乎的誤把懸浮細胞當做是死細胞。

2、細胞復蘇后，是否應該馬上離心，去掉DMSO?

  細胞復蘇后其實不適合馬上去離心，因為大部分細胞在凍存前用胰酶處理時，已經(jīng)受到了很大的刺激，復蘇時立刻離心相當于又接受了一次刺激，這樣處理會讓你的細胞“原地爆炸”，所以離心重懸這一步等幾分鐘再做，這樣細胞存活率會很高。也有人建議復蘇后的細胞（含有DMSO）加入培養(yǎng)基后培養(yǎng)，**后再換液，可以避免復蘇后細胞的生長和粘附問題（不過自己還沒有這么做過）。我們都知道DMSO在0℃以上便開始有毒性了，而不是4℃，當然4℃下操作也比在37℃下強多了。所以說，凍存時候理想的情況是在冰水混合物中混合細胞與凍存液，然后轉移至凍存管里?，F(xiàn)在很多公司已經(jīng)生產(chǎn)出無需加DMSO的細胞凍存液了，這樣處理對細胞的保存效果更好。復蘇時，凍存管入水后應在水浴中直立，水面超過凍存細胞液面高度，然后牽著管子在水面緩慢浮泳或畫圈，但不要振蕩。

3、凍存管蓋子裂開是什么原因？

  凍存管剛從液氮里拿出來的時候，用力不均很容易導致管子變形，導致管蓋受力凍裂，你可以選擇用鑷子夾住。凍存管取出后管蓋要擰緊，從液氮中取出后由于熱脹冷縮，管蓋很容易松動。這樣復蘇的時候，萬一有漏液，在水浴鍋里就會直接導致污染。同時，剛取出來的凍存管，你也要注意管內是否進入了液氮，應等揮發(fā)后再擰緊、入水，而不能直接擰蓋，否則很容易爆炸。

4、細胞離心的轉速應該是多少？

  一般來說國產(chǎn)離心機3000rpm離心3分鐘，我們細胞間的離心機壞了，調不了轉速，所以只能2000 rpm離心5分鐘，反正問題也不大。更好的是用1000rpm離心5-10分鐘，這樣比較不容易傷害細胞。不過國產(chǎn)離心機的3000rpm未必能達到3000，所以問題并不大。

5、可以在養(yǎng)細胞的過程中更換培養(yǎng)基或者血清嗎？

  千萬千萬別這么做，細胞就跟人一樣，有的人愛吃辣，有的人愛吃甜，你把一個吃慣了東北菜的人扔到重慶，剛開始的一段時間，會滿臉爆痘吧，養(yǎng)細胞也是這個道理。它們都有各自適應的培養(yǎng)基，萬一更換培養(yǎng)條件，細胞可能無法快速適應，會導致細胞大量死亡?？蒲行率只蛘咭B(yǎng)一種新的細胞，可以在ATCC官網(wǎng)查詢這種細胞適應的培養(yǎng)條件；或者如果你是從別的實驗室要來的細胞，可以咨詢之前的人是用什么條件培養(yǎng)的。血清級別、培養(yǎng)基批次也是有講究的，有些大實驗室會一次性購買同一批次的培養(yǎng)基，排除培養(yǎng)基批次不同造成的影響。當然，如果你的老板很有錢，澳洲的血清是很好的，如果資金不允許，可以備著一些少量的別血清，以防細胞狀態(tài)不好的時候急救用。

6、細胞需要多久換液？

  這個要根據(jù)細胞的生長狀態(tài)來定，當細胞代謝加快后，應該換液。細胞密度增大后，需要考慮傳代。而且我發(fā)現(xiàn)，不同的季節(jié)細胞生長速度也不同（我也搞不懂這一點，雖然一直在培養(yǎng)箱里待著）

7、培養(yǎng)基到底要不要加***？

  我看過有人說其實是不推薦加***的，但是很多時候，都會為了保險，會加上雙抗。但是要知道雙抗只能抗**，不能抗**！

8、什么時候用5%的CO2，什么時候用10%的CO2呢？有差別么？

  是有差別的，主要看你的培養(yǎng)體系，培養(yǎng)基的緩沖體系基本上都是碳酸氫鈉緩沖體系，培養(yǎng)基里的碳酸氫鈉的濃度決定了CO2的量。當碳酸氫鈉達到3.7g/L的時候，需要采用10%的CO2；當碳酸氫鈉達到1.5g/L的時候，需要用5%的CO2。如果你用的培養(yǎng)基用的是Hank'sbalanced salt solution (HBS，Hank緩沖液)的話，就不能用CO2培養(yǎng)箱了哦，因為這個體系里碳酸氫鈉濃度只有0.35g/L。

9、培養(yǎng)基在冰箱里的時候，紫紅色的培養(yǎng)基為啥會變暗？

  這個問題就很簡單了，因為冰箱里沒有5%的CO2，培養(yǎng)基變成堿性，當然顏色就變了。

10、怎么判斷細胞是否是支原體污染？ 

  我還沒有遇到過這種問題。這個是我自己查到的，僅供參考。一般來說，污染了支原體的細胞，生長狀態(tài)會變差，用肉眼基本很難判別到底是支原體污染還是你自己培養(yǎng)的時候在培養(yǎng)基里多加了一把鹽……主要還是通過PCR檢測或者是染色檢測來區(qū)分支原體污染與否的。不過一旦污染，盡量丟棄，然后查看你的血清是否**。

11、細胞鋪板的時候怎么控制細胞的量？

  這個真的是需要個人操作經(jīng)驗了。一般情況下，我們會先用牛鮑計數(shù)板進行細胞計數(shù)，然后再進行稀釋。但是個人操作對牛鮑計數(shù)板的影響實在是太大了（至少我在這一點的用的不是很好）。大部分需要細胞鋪板的實驗，比如細胞劃痕實驗，都是想讓細胞鋪滿的，如果剛開始量很少，細胞就會長的很慢很慢，慢到絕望。而且在這個過程中，也會影響到細胞的形態(tài)。

12、如何避免細胞培養(yǎng)過程中的污染？

  我覺得，我一進細胞間，就提起了12萬分的精神，一個實驗室共用一個細胞間，無菌操作敲黑板的重要。主要還是考慮無菌環(huán)境，盡量做好操作臺的**。你要是在培養(yǎng)箱里把培養(yǎng)基打翻，那就闖大禍了，這地方霉菌一旦滋生，那你就只能等著用甲醛熏蒸了，因為紫外無法殺滅霉菌，酒精也不行，只能用火，復蘇的時候，水浴鍋也是需要進行**處理的。一旦出現(xiàn)污染，就只能扔掉，game over了。

13、為什么胰酶里要加EDTA？

  并不是所有的細胞都需要胰酶消化的，胰酶消化后的細胞由于自身內部的細胞骨架張力以及培養(yǎng)液表面張力作用下成為球形。一般消化時間1-3min（具體的消化時間也要看胰酶配制的時間長短。放置時間較長的胰酶，消化效果會減弱，消化時間會加長），鏡下肉眼觀察皿底由半透明細胞單層連接成片轉為點狀透明（出現(xiàn)細小空隙），并加入適量培養(yǎng)基，終止消化，吹打分散。EDTA作為一種螯合劑，可以結合Ca、Mg這樣的二價離子。單純胰酶和單純EDTA都可以消化細胞。胰酶中加入EDTA做消化液，是聯(lián)合了兩種消化方法。由于培養(yǎng)基無法終止EDTA的消化作用，所以還需要用適量的PBS終止EDTA反應，以防影響細胞貼壁情況。

服務電話021-55130726，如想了解動物模型的更多內容，歡迎來電咨詢，我們將熱情為您服務。