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新生小鼠原代心肌成纖維細(xì)胞的分離與培養(yǎng)
1. SD大鼠，250g，通過(guò)頸椎脫位處死大鼠，浸入75%乙醇浸泡5分鐘，轉(zhuǎn)移到通風(fēng)柜中的解剖盤(pán)中。
2. 打開(kāi)皮膚，暴露、收集股骨，無(wú)菌狀態(tài)下移除附著的肌肉和組織。
3. 并轉(zhuǎn)移股骨至預(yù)冷含雙抗的PBS中，洗滌三次。冰上操作。
4. 切斷股骨骨骺， 使用5mlPBS，1ml注射器針頭沖洗，沖洗液由棕色變成粉紅色即可（股骨變白）。沖洗后，用1ml注射器吹打3-5次。
5. 70um濾網(wǎng)過(guò)濾，棄去篩網(wǎng)。使用 15ml 離心管，先加入分離液，然后緩慢加入濾過(guò)的懸液。20℃環(huán)境下，600g 離心 25min。
6. 離心后，離心管中液體由上至下分為四層。**層為稀釋液層。**層為環(huán)狀乳白色單個(gè)核細(xì)胞層。第三層為透明分離液層。第四層為紅細(xì)胞層。
7. 小心吸取離心管中的，環(huán)狀乳白色單個(gè)核細(xì)胞層，轉(zhuǎn)移到新離心管中，加入 5-10ml 洗滌液，混勻細(xì)胞。400g，離心 10min。
8. 棄去上清，用吸管吸取 5ml 清洗液重懸所得細(xì)胞。 250g，離心 10min，棄去上清。 再用M199完全培養(yǎng)基（含10 ng/mL VEGF，1 ng/mL b-FGF，1 ng/mL EGF，20%胎牛血清、1%雙抗）清洗一次，棄去上清，M199完全培養(yǎng)基重懸細(xì)胞。250g，離心 10min，棄去上清。M199完全培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，計(jì)數(shù)。
9. 按3×106/孔種入纖連蛋白包被過(guò)的24孔板，每3天換一次培養(yǎng)基，以去除非貼壁細(xì)胞，持續(xù)誘導(dǎo)培養(yǎng)2-3周。
