原代細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)

一、分離階段注意事項(xiàng)

1、組織塊培養(yǎng)法

1）組織塊接種后的前3天，從組織塊向外遷徙的細(xì)胞數(shù)很少，組織塊的黏附不牢固，在觀察和移動(dòng)的過(guò)程中，注意不要引起液體的振蕩。要避免經(jīng)常翻動(dòng)和振動(dòng)，否則組織塊不易附著于瓶壁上或附著后也會(huì)脫落飄起。

2）加入的培養(yǎng)液不適合過(guò)多，避免浸泡的組織塊受輕微的波動(dòng)而脫落下來(lái)。

3）用組織塊培養(yǎng)時(shí)，要及時(shí)觀察，當(dāng)細(xì)胞向外遷徙出來(lái)后要注意記錄并去除漂浮的組織塊和殘留的細(xì)胞，因?yàn)橐哑〉慕M織塊和那些細(xì)胞碎片已經(jīng)死亡，它們產(chǎn)生的有毒物質(zhì)會(huì)影響原代細(xì)胞的生長(zhǎng)，要及時(shí)**。

4）為促進(jìn)組織塊盡快粘貼在培養(yǎng)瓶皿上，可以在種植前先將膠原薄層涂在培養(yǎng)瓶底壁上。細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中，膠原中的促細(xì)胞貼附因子先吸附于培養(yǎng)瓶底壁上，懸浮的圓形細(xì)胞再與已吸附有促貼物質(zhì)的底壁附著。

2、貼壁型原代細(xì)胞

1)原代培養(yǎng)的分離細(xì)胞在初次接觸體外環(huán)境時(shí)，雖然被分散成單個(gè)細(xì)胞，但它們之間的互相影響還是存在的，而且這種影響對(duì)細(xì)胞能否存活是非常重要的。在這些細(xì)胞之間能產(chǎn)生一些促生長(zhǎng)的活性物質(zhì)，使細(xì)胞彼此互相促進(jìn)存活和生長(zhǎng)。如果接種的細(xì)胞密度過(guò)低，細(xì)胞之間的促生長(zhǎng)作用很小，雖然營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)很充足，也很難使細(xì)胞適應(yīng)從體內(nèi)的組織環(huán)境到被分散后進(jìn)入獨(dú)立生存環(huán)境的變化過(guò)程。如果接種的細(xì)胞密度過(guò)大，會(huì)導(dǎo)致?tīng)I(yíng)養(yǎng)物質(zhì)供應(yīng)不足，代謝廢物積累較快需要經(jīng)常換液和傳代。

2）原代培養(yǎng)時(shí)初始培養(yǎng)在組織分散和分離細(xì)胞時(shí)細(xì)胞可能會(huì)受到嚴(yán)重的損傷。適當(dāng)增大原代培養(yǎng)接種的細(xì)胞密度，給培養(yǎng)的細(xì)胞提供更多的類似于在體內(nèi)時(shí)細(xì)胞之間的相互作用，會(huì)提高原代培養(yǎng)的細(xì)胞在體外存活率。待細(xì)胞適應(yīng)體外環(huán)境后進(jìn)行傳代培養(yǎng)時(shí)再以較低的密度接種和培養(yǎng)。

3）由于細(xì)胞之間的相互的內(nèi)在聯(lián)系被打破，分離細(xì)胞在體外培養(yǎng)時(shí)經(jīng)歷的生存環(huán)境改變很大，在體外存活和生長(zhǎng)的難度相應(yīng)增加。對(duì)于貼壁依賴性細(xì)胞來(lái)說(shuō)，盡快使接種的細(xì)胞貼壁，是決定培養(yǎng)能否成功的關(guān)鍵。可以在接種后先將培養(yǎng)瓶置培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)3h到5h，由于細(xì)胞懸液中帶有少量培養(yǎng)液，細(xì)胞即可以維持存活，又可以很快接觸到培養(yǎng)瓶底壁，是細(xì)胞迅速黏附于底物，待細(xì)胞貼壁后，再補(bǔ)足培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)。

3、懸浮型原代細(xì)胞

1）進(jìn)行懸浮細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)保持細(xì)胞的懸浮狀態(tài)?？梢酝ㄟ^(guò)增加培養(yǎng)液的黏度來(lái)幫助細(xì)胞呈懸浮狀態(tài)，如給培養(yǎng)液中加入低濃度的透明質(zhì)酸復(fù)合物。在有攪拌裝置的培養(yǎng)器皿內(nèi)加入培養(yǎng)液是，以5ml為低限度，否則攪拌時(shí)會(huì)產(chǎn)生氣泡對(duì)細(xì)胞造成傷害。使用這種方式需注意勿使攪拌速度過(guò)快，否則即可使培養(yǎng)液溢出又容易造成污染。如果培養(yǎng)液的量在5ml以下，可以采用旋轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)。給懸浮培養(yǎng)的細(xì)胞換液時(shí)要注意不要吸出細(xì)胞。

2）能夠進(jìn)行懸浮培養(yǎng)的細(xì)胞，其生命力一般都比較旺盛，體外分裂增殖的速度較快，營(yíng)養(yǎng)成分消耗大，換液時(shí)間隔一般較短。

二、分離后-傳代前注意事項(xiàng)

1、在原代培養(yǎng)的1天到2天內(nèi)，要特別注意觀察是否有**、**的污染，一旦發(fā)現(xiàn)，要及時(shí)**，防止造成其它細(xì)胞的交叉感染；

2、在細(xì)胞培養(yǎng)的過(guò)程中，要注意培養(yǎng)液顏色的變化，并根據(jù)培養(yǎng)液的顏色來(lái)決定換液時(shí)間。正常情況下，培養(yǎng)液呈桃紅色；當(dāng)培養(yǎng)液呈橙黃色時(shí)，細(xì)胞一般生長(zhǎng)情況良好；呈淡黃色時(shí)，可能培養(yǎng)時(shí)間較長(zhǎng)，營(yíng)養(yǎng)不足，死亡細(xì)胞較多。所以，應(yīng)在培養(yǎng)液略黃時(shí)吸出部分舊培養(yǎng)液，然后補(bǔ)加同等數(shù)量的新鮮培養(yǎng)液。換液過(guò)程中，不要吸出細(xì)胞，不要使培養(yǎng)液溢出培養(yǎng)瓶，避免各種微生物的污染。換液時(shí)，應(yīng)將培養(yǎng)液事先預(yù)溫至37℃。

一般培養(yǎng)**，組織細(xì)胞即可在培養(yǎng)瓶皿底壁黏附并貼壁生長(zhǎng)。2天到3天后，細(xì)胞恢復(fù)增殖活動(dòng)。隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，細(xì)胞數(shù)量逐漸增多，消耗的營(yíng)養(yǎng)物越來(lái)越多，需要換液的時(shí)間越來(lái)越短。

三、傳代注意事項(xiàng)

1、離體培養(yǎng)的細(xì)胞生命力比較脆弱，因此傳代時(shí)細(xì)胞沒(méi)有生長(zhǎng)到培養(yǎng)瓶底壁面積的80%以前，不要急于傳代。

2、次傳代，由于原代培養(yǎng)中各種類型的細(xì)胞?；祀s生長(zhǎng)，傳代時(shí)不同細(xì)胞又不同的消化時(shí)間，因而要根據(jù)需要注意及時(shí)處理。

3、對(duì)貼壁細(xì)胞消化后的吹打過(guò)程要有序進(jìn)行，吹打時(shí)動(dòng)作不宜過(guò)猛，否則會(huì)直接損傷細(xì)胞并產(chǎn)生能傷害細(xì)胞的氣泡。

4、次傳代時(shí)適當(dāng)增大接種的細(xì)胞密度，使培養(yǎng)的細(xì)胞間盡快發(fā)生相互作用，有利于傳代細(xì)胞的存活。

5、傳代對(duì)細(xì)胞的影響或傷害程度僅次于將活細(xì)胞從生物體內(nèi)取出并進(jìn)行原代培養(yǎng)的程度。只是因?yàn)閭鞔蟮募?xì)胞生長(zhǎng)并不像剛開(kāi)始原代培養(yǎng)時(shí)那樣緩慢罷了。

6、盡可能減少傳代次數(shù)。每經(jīng)過(guò)一次傳代，細(xì)胞的生長(zhǎng)環(huán)境就相應(yīng)發(fā)生一次較大變化。體外生長(zhǎng)的細(xì)胞若處于動(dòng)蕩的生活環(huán)境中，細(xì)胞的遺傳特性往往容易發(fā)生改變。經(jīng)過(guò)多次傳代培養(yǎng)的細(xì)胞，往往容易轉(zhuǎn)化為惡性細(xì)胞