Tunel顯色法細(xì)胞凋亡檢測實(shí)驗(yàn)

實(shí)驗(yàn)背景及原理：

     細(xì)胞凋亡是細(xì)胞的一種基本生物學(xué)現(xiàn)象，在生物體進(jìn)化、內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定以及系統(tǒng)發(fā)育中發(fā)揮著重要的作用。細(xì)胞在發(fā)生凋亡時，會在生理生化和細(xì)胞形態(tài)上發(fā)生一系列變化，在凋亡中晚期，激活的DNA內(nèi)切酶會切斷核小體間的基因組DNA，DNA會被降解成為約180bp-200bp 的片段，而正常或者增殖細(xì)胞很少發(fā)生DNA斷裂。利用這個差異，用脫氧核糖核苷酸末端轉(zhuǎn)移酶（TdT 酶）把Biotin標(biāo)記的dUTP標(biāo)記到斷裂DNA片段的3’-OH 末端，用POD檢測標(biāo)記并用底物顯色，然后進(jìn)行顯微鏡觀察，這個方法被稱為TUNEL(TdT-mediated dUTP Nick-End Labeling)法細(xì)胞凋亡檢測。

應(yīng)用：（1）可用于腫瘤細(xì)胞和組織在內(nèi)的不同種類病理標(biāo)本研究；

      （2）可應(yīng)用于臨床診療，新藥研制、生物制品開發(fā)、腫瘤放化療、以及從促凋亡角度探索腫瘤的基因**；

      （3）對相關(guān)疾病的早期發(fā)現(xiàn)、放化療的療效評價具有舉足輕重的地位。

TUNEL檢測法的優(yōu)勢：

    TUNEL法實(shí)際上是分子生物學(xué)與形態(tài)學(xué)相結(jié)合的研究方法，對完整的單個凋亡細(xì)胞核或凋亡小體進(jìn)行原位染色，能準(zhǔn)確的反應(yīng)細(xì)胞凋亡典型的生物化學(xué)和形態(tài)特征，可用于石蠟包埋組織切片、冰凍組織切片、培養(yǎng)的細(xì)胞和從組織中分離的細(xì)胞的細(xì)胞凋亡測定，并可檢測出極少量的凋亡細(xì)胞，靈敏度遠(yuǎn)比一般的組織化學(xué)和生物化學(xué)測定法要高，因而在細(xì)胞凋亡的研究中已被廣泛采用。

樣本類型：石蠟包埋組織切片、組織冰凍切片、細(xì)胞涂片以及貼壁細(xì)胞

注意事項：為了避免試劑損失，使用前可以低速短暫離心融化后的試劑，然后小心開管取用；

          試劑盒使用后盡快放回-20℃冰箱保存；

          TUNEL反應(yīng)液即用即配，不能配制好后存放；

          TdT 酶在-20℃保存時不會凝固，不需要提前取出融化，只需在使用前迅速從-20℃冰箱中拿出取用后立即放回-20℃保           存；

          POD反應(yīng)液用POD貯液和POD稀釋液即用即配，配制好后可以4℃保存（3個月），POD可以-20℃保存；

          標(biāo)記反應(yīng)混合液包含二甲胂酸鉀（potassium cacodylate），避免接觸皮膚和眼睛，操作時戴好手套；

          如果用于石蠟切片的檢測，需用蛋白酶K，二甲苯處理；

          在標(biāo)記反應(yīng)中，推薦使用蓋片或封口膜覆蓋樣本，反應(yīng)液均勻分布，并避免孵育過程中緩沖液蒸發(fā)損失。準(zhǔn)備覆蓋           膜時，可剪下一片Parafilm®封口膜，使其稍大于樣本，并將一角折起便于在接下來實(shí)驗(yàn)步驟中取放；

          用塑料或玻璃容器及紙巾自制濕盒，在樣本處理過程中使用濕盒保持樣本環(huán)境的濕潤，避免樣本干燥；

          固定樣品，需自備多聚甲醛；

          懸浮細(xì)胞可用以下方法固定或貼附在玻片上：4°C緩慢離心（1000rpm）5分鐘，去除細(xì)胞培養(yǎng)上清，并將細(xì)胞重新懸浮           在4%的甲醛溶液（溶于1×PBS 溶液）使其終密度為1×106/ml，室溫孵育10 分鐘。按照上述方法離心收集細(xì)胞，去除           固定液并用80%乙醇溶液以相同細(xì)胞密度重懸。固定后的細(xì)胞可以保存在4°C。固定后的細(xì)胞（100-300μl）可直接固           定在玻片上，使用聚L-賴氨酸包被的玻片可以提高細(xì)胞的黏附性。