1.怎么判斷抗體滿足ChIP要求？

通常每個(gè)公司的抗體說明都標(biāo)有級(jí)別（grade），ChIP級(jí)。如果沒有，通常的規(guī)則是ChIP-PCR分析陽(yáng)性control是陰性control的5倍以上的抗體認(rèn)為是到達(dá)了ChIP級(jí)。

2.如果沒有商業(yè)化的kit怎么辦？

表達(dá)的表位標(biāo)記的蛋白也可以。經(jīng)常使用的標(biāo)簽包括HA，F(xiàn)lag，Myc和V5。除了表位的抗體，所述靶蛋白也可以標(biāo)記有生物素受體序列，其可以與生物素經(jīng)由生物素連接酶在體內(nèi)或體外進(jìn)行標(biāo)記。

3.多少細(xì)胞數(shù)合適？

10^6到10^7個(gè)細(xì)胞才能終得到10到100ng ChIPed DNA。一般10^6可以滿足高豐度蛋白（如RNA polymerase II）和局部組蛋白修飾（如H3K4me3）的ChIP。如果是低豐度的轉(zhuǎn)錄因子蛋白和其他組蛋白修飾則需要10^7個(gè)細(xì)胞。

4.用什么作為Control？

關(guān)于control是問得多，也是困惑的一個(gè)問題。

不推薦IgG，原因是：，大多數(shù)的IgG抗體不是來源于轉(zhuǎn)錄因子或特定組蛋白抗體同一動(dòng)物的免疫前血清。**，IgG通常pull down非常少的DNA，這樣導(dǎo)致在后期的建庫(kù)過程中PCR Cycles 數(shù)增加，導(dǎo)致不能達(dá)到作為control去除背景噪音的目的（會(huì)缺失和放大部分信息）。

因此比較而言，Input更適合作為control。Input的建庫(kù)量夠，這樣建庫(kù)過程不需要over-amplifed，bias小。其次，后測(cè)序得到的數(shù)據(jù)更均勻，以及全基因組覆蓋度會(huì)更好。有人提到deletion 或者 RNAi knockdown目標(biāo)轉(zhuǎn)錄因子的細(xì)胞同時(shí)做ChIP-Seq作為control更好。

5.是否需要生物重復(fù)？

有人建議需要生物重復(fù)，但是從我經(jīng)歷的項(xiàng)目來看，生物重復(fù)性不太好。還有人推薦用不同公司的抗體來做生物重復(fù)，這就需要考慮到經(jīng)費(fèi)的問題。

6.關(guān)于超聲處理

超聲沒有什么特別的，需要注意的是超聲處理在含有SDS的緩沖液中可能會(huì)破壞蛋白質(zhì)－蛋白質(zhì)和蛋白質(zhì)－DNA相互作用。但是含有SDS的緩沖液能增加超聲的效率，適應(yīng)與DNA緊密結(jié)合的轉(zhuǎn)錄因子的ChIP-Seq。近遇到一個(gè)老師，他的項(xiàng)目是一個(gè)轉(zhuǎn)錄因子跟不同的Parters蛋白結(jié)合，再binding到相關(guān)的區(qū)域，行使調(diào)控功能。這種情況就不建議用含有SDS的緩沖液了。

7.交給Vendor后是否萬事大吉？

這里還提些數(shù)據(jù)分析過程中需要注意的問題。需要多少數(shù)據(jù)量？大部分人認(rèn)為20 Mb 是個(gè)比較適合選擇。

Call peak不同軟件各有優(yōu)勢(shì)。

Peak 類型	適合項(xiàng)目	工具
大（Broad）	組蛋白	CCAT,SICER
小（Sharp）	轉(zhuǎn)錄因子	MACS
大和?。⊿harp&Broad）		ZINBA

需要注意的是重復(fù)區(qū)域的peaks可能被忽視，原因是在前期的數(shù)據(jù)處理過程中，mapped到不同位置的reads被丟掉，而這些reads大部分是因?yàn)楸葘?duì)到重復(fù)區(qū)域。

另外一個(gè)問題是怎么比較不同細(xì)胞和不同條件下ChIP后測(cè)序得到的數(shù)據(jù)。ChIP條件的不同，背景噪音也不同，加上測(cè)序系統(tǒng)誤差，所以需要均一（normalization）的軟件在樣本比較前對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行預(yù)處理。近有個(gè)工具DIME可以處理這個(gè)問題。