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MTT實驗步驟及注意事項
MTT全稱為3-（4,5-dimethyl-2-thiazolyl)-2,5-diphenyl-2-H-tetrazolium bromide，漢語化學(xué)名為 3-（4，5-二甲基噻唑-2）-2，5-二苯基四氮唑溴鹽，商品名：噻唑藍(lán)。是一種黃顏色的染料。MTT法，又稱MTT比色法，是一種檢測細(xì)胞存活和生長的方法。其檢測原理為活細(xì)胞線粒體中的琥珀酸脫氫酶能使外源性MTT還原為水不溶性的藍(lán)紫色結(jié)晶甲瓚（Formazan）并沉積在細(xì)胞中，而死細(xì)胞無此功能。二甲基亞砜（DMSO）能溶解細(xì)胞中的甲瓚，用酶聯(lián)免疫檢測儀在490nm波長處測定其光吸收值，可間接反映活細(xì)胞數(shù)量。在細(xì)胞數(shù)范圍內(nèi)，MTT結(jié)晶形成的量與細(xì)胞數(shù)成正比。
MTT細(xì)胞實驗步驟
1、細(xì)胞種板：將對數(shù)生長期細(xì)胞用胰蛋白酶消化，配制成濃度為1-10×104個/ml的細(xì)胞懸液，按10000細(xì)胞／孔接種于96孔板，每孔加100μl，置于CO2（5％）培養(yǎng)箱中37℃下培養(yǎng)24h以貼壁。
2、加藥處理：繼續(xù)培養(yǎng)0h、12h、24h、36h分別更換為100μl細(xì)胞樣品各自對應(yīng)的含有濃度藥物的培養(yǎng)基，對照組更換為含溶劑的培養(yǎng)基，分別記為藥物處理48h、36h、24h、12h。每個樣本濃度設(shè)三個重復(fù)。
3、MTT反應(yīng)：所有孔中加入20μl 濃度為5mg/ml的、新鮮配制的MTT溶液，培養(yǎng)箱中孵育4小時，使MTT還原為甲瓚（此時倒置顯微鏡下可看到孔板內(nèi)的細(xì)胞周圍出現(xiàn)絲狀紫色結(jié)晶體）。
4、DMSO溶解甲瓚：小心的吸除上清液，每孔加DMSO（二甲基亞砜）150μl，用搖床搖勻。
5、測吸光度值：使用酶標(biāo)儀測定570nm光吸收值，以溶劑處理細(xì)胞為對照組，按公式計算藥物對細(xì)胞的抑制率。
抑制率＝1－（實驗組-空孔）/（對照組-空孔）
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