DNA測序是一種多步驟的復雜過程,是重組DNA技術的前提,測序結果結合計算機分析是獲得限制性酶譜常用、快捷的方法。對于獲得的未知片段,只有了解了核苷酸順序才能進行下一步實驗操作,而且有可能利用生物信息學方法由序列本身推測其功能。DNA測序也是突變檢測為直接、可靠的方法。

廣泛應用的DNA測序方法有酶促雙脫氧法和化學法。前者是利用DNA聚合酶來合成一種標記的與DNA模板互補的鏈來進行測序;后者是以標記的DNA鏈在一系列堿基特異性化學試劑作用下來完成測序工作。一般來說,以上兩種方法測序結果較為可靠,且重復性好,但在DNA測序中也常常存在一些問題,可影響測序效能和結果的準確性及重復性。

測序中常見的模板特異性問題和解決方法

無論手工測序還是測序儀自動測序,都存在下列問題。

1 測序結果信號弱,無法正常讀取序列

常見原因:模板量不足,測序模板量主要取決于模板長度和種類。若為PCR產物測序,一般要求100ng/kb,而質粒DNA可稍多,為100～200ng/kb。

對策:按照要求準確加入所需模板量,具體操作如下:對測序模板進行聚丙烯酰胺凝膠電泳(敏感度高于瓊脂糖凝膠),同時加入定量Marker來判斷模板濃度,可粗略目測或應用凝膠自動分析儀中的Gelworks1DAdvanced軟件進行定量分析;也可用紫外分光光度計分別測量OD260和OD280測定模板DNA的濃度和純度。2種方法中的一種都可能受外界因素影響,所以2種方法聯(lián)用更為科學。

2 測序信號模糊,信噪比顯著升高

常見原因:模板DNA污染,可能是PEG,EDTA,RNA或其他DNA導致酶活性受抑制。

對策:對測序模板進行聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測,觀察模板DNA是否為單一條帶,若條帶為非單一,可以低熔點瓊脂糖凝膠回收并用專用試劑盒純化,注意純化后要進行電泳檢測。

3 測序信號提前共同終止,測序反應無法繼續(xù)進行

常見原因:模板DNA中有二級結構形成[3]、dNTP濃度不當或模板濃度過大,導致測序反應提前終止。

對策:一般商售試劑盒中配套試劑很少出現問題,若為自制試劑,可予替換或重新配制,再重復實驗。由于測序反應要求模板為單鏈,所以對于二級結構形成導致的測序反應共同終止,可以提高模板變性溫度使之充分分解為單鏈,或加入甲酰胺使模板變性充分、。

4 無正常測序信號

常見原因:引物設計不當或模板G2C含量過高。對策:測序引物通常分為通用引物和特異性引物。前者是針對不同克隆載體設計的引物,一般不會存在上述問題。特異性引物是指與模板特異性且性結合的引物,設計原則如下:(1)引物長度≥18bp,一般20～25bp;(2)G2C含量≥50%,一般為50%～60%;(3)避免引物自身形成互補;(4)3′末端為G或C更為合理。模板G2C含量過高者可采用專門為高G2C含量模板設計的測序試劑盒?？拷锏膮^(qū)域,其測序信號可能由于引物峰遮蓋而無法閱讀,是測序的難點?？梢試L試加入Mn2+(100mmol/LMnCl21μl),可部分解決問題。

測序反應可能存在局部的誤差或錯誤,因此,需要對測序樣品進行雙向測序,尤其是在突變檢測中,要慎重,對于陽性病例,除了常規(guī)的雙向測序外,還要重復測序以使結果更為可靠。

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