3 放射性損傷血虛證動物模型

放射性損傷是利用60Coγ射線等照射動物全身,可使動物造血干/祖細胞減少,造成白細胞數(shù)量下降和骨髓損傷,造模效果明顯,但需要特殊設備,而且照射量的控制有難度,過小達不到損傷要求,過大又會造成動物死亡。

為研究輻射所致血虛證模型小鼠的發(fā)病機制,馬增春以不同劑量(2.5、5.5、7.5Gy)γ射線照射,誘發(fā)不同程度的小鼠血虛證,分別檢測各組小鼠指標改變情況。結果小鼠在7d左右出現(xiàn)不同程度的血虛征象:皮毛干燥、光澤差、懶動。形態(tài)學檢查顯示,照射后各劑量組小鼠的骨髓和脾臟細胞出現(xiàn)典型凋亡變化,以照射后24h內明顯,隨后逐漸減少,7d左右基本消失;照射后24h內各劑量組小鼠骨髓和脾臟細胞DNA凝膠電泳出現(xiàn)明顯梯狀帶,隨著時間的推移,梯狀帶減弱、消失;小鼠照射后6h骨髓細胞凋亡率高,以5.5Gy照射組為明顯;CD34+細胞在骨髓有核細胞中的比例隨照射劑量加大而降低,在5.5Gy照射后14d內小鼠骨髓中CD34+細胞減少表現(xiàn)為持續(xù)性。5.5Gy照射后小鼠骨髓細胞周期紊亂。譚洪玲等采用60Coγ射線全身1次照射,照射劑量為3.5Gy,制備血虛證模型,造模后第7天進行骨髓集落細胞培養(yǎng),造模后第7天和第14天檢測CD34+細胞。結果表明:模型對照組小鼠骨髓中的CFU-GM、CFU-E、BFU-E、CFU-meg、CFU-mix明顯減少,CD34+細胞比例亦顯著減少。**方劑可顯著逆轉上述改變。放射線照射還可使小鼠骨髓細胞在G2/M期阻滯,導致凋亡細胞增多。

劉永學等分別采用2.5、5.5、7.5Gy的γ射線照射小鼠,觀察不同輻射劑量對血虛證模型的影響。結果顯示,經不同劑量射線照射后,小鼠出現(xiàn)不同程度的血虛證表現(xiàn),外周血白細胞數(shù)明顯下降,各劑量組小鼠骨髓和脾臟細胞出現(xiàn)典型的凋亡變化。蒲春霞等采用3.5Gy60Coγ射線全身1次照射小鼠,制備血虛證模型,結果顯示,模型小鼠外周血白細胞和血小板數(shù)量顯著降低,脾結節(jié)生成單位和粒系-巨噬系集落生成單位顯著降低。而**方劑可程度逆轉上述變化。佟麗等應用細胞因子寡核苷酸表達譜芯片檢測放射線致血虛小鼠不同臟器組織內造血相關細胞因子差異表達情況。結果顯示,放射線照射后不同時間點各臟器組織血虛組均有表達下調的基因,這些差異表達的細胞因子基因的功能大致分為3類:促細胞生長或增殖、免疫調節(jié)和誘導血細胞的形成或促造血祖細胞的集落形成。實驗中檢測到輻照后2h參與免疫應答的細胞因子基因IL-2下調,6h后間接促進造血的IL-4、IL-8R表達下調,提示造血系統(tǒng)功能開始下降,到12h時,促紅細胞生成的PDGF-R、促GM-CSF生成的IL-18及主要造血因子G-CSF本身均下調。脾臟組織在照射后12h發(fā)現(xiàn)1個上調的基因IL-12b,該因子具有直接促進骨髓干細胞的增殖和形成集落作用。腎臟組織在照射后6h出現(xiàn)大量下調基因,其中包括c-fos、c-jun原癌基因,它們均是在核中參與轉錄調控的基因。由此推測血虛證的形成可能在基因轉錄過程中就已開始。高月等比較了3.5、5.5、7.5Gy60Coγ射線照射制備的血虛證模型后得出結論:7.5Gyγ射線照射后,骨髓造血功能嚴重受抑,骨髓有核細胞極少,中藥**方劑對其無**作用;5.5Gyγ射線照射所致的損傷,只有在動物預防給藥連續(xù)7d后,方能程度促進造血功能恢復;3.5Gy照射劑量是此類模型制作的佳照射劑量,便于中藥**類方劑及單藥的藥效學評價。

4 免疫介導型血虛證動物模型

免疫介導型再生障礙性貧血模型的建立創(chuàng)于1967年。后來又進行了改良。梁毅等用該方法制備血虛證小鼠模型并研究了**方藥對其的**作用。具體方法為:取DBA/2小鼠,斷頸處死,95%乙醇浸泡消毒后,無菌條件下取出胸腺及頸、腋下、腹股溝**結,加RPMI1640培養(yǎng)液,除去表面血污及黏附的結締組織后,制成單細胞懸液,細胞計數(shù),調節(jié)細胞濃度為1×106/ml,其胸腺細胞與**結細胞比為1∶2,并鑒定細胞活性應在95%以上。Balb/c小鼠經X射線6.0Gy/3min亞致死劑量照射后1～4h內,立即經尾靜脈輸入上述細胞懸液,每只0.2ml。其機制在于Balb/c小鼠經亞致死量照射后,機體的免疫功能嚴重受損,再輸入同基因H-2,但Mls抗原不同的DBA/2小鼠的胸腺和**結混合細胞,這些免疫活性細胞在宿主體內生存,使宿主出現(xiàn)造血抑制細胞和血漿CFU-GM抑制活性,從而導致造血干細胞數(shù)量明顯減少并出現(xiàn)缺陷,使自身復制的速率低于分化率,終引起全血細胞減少。實驗表明,造模8～14d小鼠出現(xiàn)明顯的血虛證癥狀體征:精神萎靡,倦臥少動,嗜睡,毛色枯黃蓬松,眼睛淡白無神,唇鼻蒼白無華,耳、尾蒼白而涼,團縮拱背,明顯消瘦,飲水增多。并出現(xiàn)全血細胞顯著減少、骨髓有核細胞顯著下降等病理學特征。