隨著低氧訓(xùn)練研究的不斷深入，研究者們發(fā)現(xiàn)低氧訓(xùn)練除了應(yīng)用于運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練提高運(yùn)動(dòng)能力之外，還對(duì)健身、疾病的**也有很大作用。,已有關(guān)于低氧運(yùn)動(dòng)**心血管疾病、糖尿病、肥胖、貧血等疾病的研究報(bào)道。

臨床上促進(jìn)****新生的方法主要采用**性血管新生療法，如使用激光進(jìn)行心肌內(nèi)血管重建術(shù)；給予促血管生長(zhǎng)因子；細(xì)胞移植；藥物**等，但這些**方法存在一些局限和**隱患。

研究表明CD34能突出地顯示心組織中較小的和不成熟的微血管或單一的內(nèi)皮細(xì)胞，是血管新生研究的一些局限和**隱患。

研究表明CD34能突出地顯示心組織中較小的和不成熟的微血管或單一的內(nèi)皮細(xì)胞，是血管新生研究的一種可靠的標(biāo)記物質(zhì)。本研究采用遞增負(fù)荷跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練及低氧作為處理因素,建立大鼠低氧訓(xùn)練模型。用CD34抗體標(biāo)記心肌組織微血管,探討低氧訓(xùn)練對(duì)大鼠心肌組織血管新生的影響，為**性血管新生療法提供新的思路和研究途徑。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)對(duì)象及分組

健康雄性2.0月齡Sprague-Dawley大鼠60只,體重約220 g(由中南大學(xué)湘雅醫(yī)學(xué)院動(dòng)物學(xué)部提供)。用標(biāo)準(zhǔn)嚙齒類動(dòng)物飼料喂養(yǎng),生活期間室溫保持20～23℃,相對(duì)濕度45%～55%,每天光照12 h。適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后,隨機(jī)分為6組：1對(duì)照組（正常大氣壓下的氧含量）、2高住組（低氧環(huán)境下居?。?/span>3常練組（常氧條件下訓(xùn)練）、4低住高練組(常氧條件下居住，低氧條件下訓(xùn)練)、5高住低練組（低氧條件下居住，常氧條件下訓(xùn)練）和6高住高練組（低氧條件下居住，低氧、常氧訓(xùn)練交替進(jìn)行），每組10只。

1.2 運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練安排常練組大鼠訓(xùn)練方案（速度×持續(xù)時(shí)間）

星期一星期二星期三星期四星期五星期六第1周15×2515×2515×2516×2516×2516×25第2周17×2517×2517×2518×2518×2518×25第3周19×3019×3019×3020×3020×3020×30第4周21×3521×3521×3522×3522×3522×35第5周23×4023×4023×4024×4024×4024×40第6周25×4525×4525×4525×4525×4525×45第7周26×4526×4526×4526×4526×4526×45第8周26×5026×5026×5026×5026×5026×50第9周27×5027×5027×5027×5027×5027×50第10周28×5028×5028×5028×5028×5028×50速度：m/min；持續(xù)時(shí)間：min；跑臺(tái)坡度：10%。1.3 低氧處理

采用美國(guó)Hypoxico公司的低氧裝置，用美國(guó)產(chǎn)TOXIRAEPGM-36型氧氣監(jiān)測(cè)儀實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)低氧艙中氧含量的變化，第1周至第7周低氧程度逐周遞增，分別為：1 800 m、2 100 m、2 400 m、2 700 m、3 000 m、3 300 m、3 600 m，第7周后保持3 600 m到第10周，所有高住組大鼠全部在低氧艙中居住。

1.4 實(shí)驗(yàn)取材

訓(xùn)練方案結(jié)束后，每組隨機(jī)取4只大鼠，用0.4%****鈉1 mL/100 g體重麻醉后，將大鼠呈仰臥位固定于手術(shù)臺(tái)上，暴露胸腔；從主動(dòng)脈胸部近心端插入細(xì)塑料管，扎緊固定，緩慢注入1%肝素2 mL；然后快速滴灌250 mL0.85%的生理鹽水，迅速剪斷后腔靜脈；待生理鹽水滴完后，換滴50 mL4%多聚甲醛緩沖鹽溶液(0.01 M、pH7.4PBS)，快速滴完，整個(gè)滴灌時(shí)間約30 min；取出整心置同一固定液中固定24 h后，將心臟沿房間隔、室間隔所在平面切開(kāi)，常規(guī)脫水、透明、進(jìn)蠟、石蠟包埋，用于免疫組織化學(xué)標(biāo)本制作。

1.5 心肌組織CD34免疫組織化學(xué)標(biāo)本制作

石蠟切片脫蠟至蒸餾水；用0.3%H2O2阻斷內(nèi)源性過(guò)氧化物酶，用0.3%TritonX-100處理增加標(biāo)本通透性，用0.01 mol、pH6.0的檸檬酸緩沖液微波修復(fù)抗原；羊血清(1∶50)處理標(biāo)本，減少和消除非特異性染色；分別加一抗(1∶500,兔源CD34單克隆抗體)、二抗(1∶200)、ABC復(fù)合物(1∶1∶100)，37℃恒溫箱于濕盒內(nèi)孵育；用終濃度為0.05%DAB-0.03%H2O2的TB顯色；鏡下控制顯色時(shí)間，顯色時(shí)間5～15 min；蘇木精襯染，常規(guī)脫水、透明，中性樹(shù)膠封片。用PBS代替一抗作為空白對(duì)照。

1.6 微血管密度的計(jì)算方法

按照Weinder報(bào)告的方法進(jìn)行結(jié)果判斷，用血管數(shù)目的平均數(shù)來(lái)表示。先在低倍鏡（×40）下掃描整個(gè)視野的區(qū)域，選擇其中高陽(yáng)性物質(zhì)表達(dá)密度區(qū)，然后在高倍鏡（×200）下計(jì)數(shù)被抗CD34抗體染成棕色的血管數(shù)目，每個(gè)染成棕色的血管內(nèi)皮細(xì)胞或血管內(nèi)皮細(xì)胞簇，只要它們和臨近的微血管、心肌細(xì)胞或其它結(jié)締組織分開(kāi)，就把它們視為一個(gè)微血管。結(jié)果用5個(gè)200倍視野下的血管數(shù)目的平均數(shù)來(lái)表示。

1.7 微血管灰度水平和表達(dá)面積的測(cè)試 用SimplePCI圖象分析系統(tǒng)對(duì)免疫組化陽(yáng)性產(chǎn)物的灰度和面積進(jìn)行分析。具體步驟：每張切片在10×40倍鏡下選取不相重疊的3個(gè)代表性視野，測(cè)量陽(yáng)性產(chǎn)物的面積和灰度值以及所選區(qū)域的平均灰度值。

1.8 統(tǒng)計(jì)分析

所得數(shù)據(jù)用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件處理。數(shù)據(jù)用平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，各組間顯著性差異采用方差分析，組內(nèi)顯著性差異用t檢驗(yàn)。顯著性水平為α=0.05，P<0.05為差別具有顯著性，P<0.01為差別具有非常顯著性。

2 結(jié) 果

2.1 大鼠心肌組織CD34免疫組織化學(xué)觀察結(jié)果 大鼠心肌組織血管經(jīng)CD34免疫組織化學(xué)染色呈棕黃色,著色鮮明,血管管腔明顯。CD34 的染色定位于血管內(nèi)皮細(xì)胞膜上，呈棕黃色，細(xì)胞核呈紫色。微血管的形態(tài)不規(guī)則，有的新生血管已呈管腔結(jié)構(gòu)，有的只見(jiàn)內(nèi)皮細(xì)胞呈條索狀或點(diǎn)狀分布。

（group）光密度值

（optical density）陽(yáng)性物質(zhì)表達(dá)面積

/um2（area）微血管密度個(gè)數(shù) /mm2

（capillary density）161.0 543±2.84 8913 657.045±546.71 4537.1 362±1.04 881263.9 778±3.16 1814 181.702±727.66 9468.2 563±2.16 795382.7 932±3.74 15412 364.528±1474.90 078**25.3 422±3.88 158**495.4 952±4.76 10623 855.051±3 319.40 152**#32.0 342±9.54 289**##5102.5 280±3.31 47024 245.952±3 584.27 104**#32.5 342±9.54 289**##6114.6 824±3.93 07429 267.503±4 701.86 546**##35.6 477±4.80 278**## 注：“*”代表與正常對(duì)照組比較，“*”P(pán)<0.05，“**”P(pán)<0.01；“#”代表與常氧運(yùn)動(dòng)組比較，“#”P(pán)<0.05，“##”P(pán)<0.01。

3 分析與討論

血管新生(angiogenesis)主要是在原有的****與/或微靜脈基礎(chǔ)上通過(guò)血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖和遷移,從先前存在的血管處以芽生或非芽生(或稱套迭)的形式生成新的****的過(guò)程。影響血管新生的因素有很多，如鍛煉、缺血、低氧、腫瘤等一些生理或病理過(guò)程，這些過(guò)程都能誘發(fā)血管的新生。人類生來(lái)具有冠狀動(dòng)脈側(cè)支血管,但沒(méi)有充分的側(cè)支循環(huán)。心肌缺血缺氧刺激可以誘導(dǎo)側(cè)支循環(huán)的開(kāi)放和血管新生，改善心肌缺血狀態(tài),使冠心病患者得到有效的**，對(duì)心肌梗塞后微血管的重建也有積極的意義，但缺氧誘導(dǎo)血管新生的程度與低氧濃度、刺激時(shí)間的長(zhǎng)短、有無(wú)運(yùn)動(dòng)介入等因素有關(guān)。

3.1 低氧與血管生成 本研究發(fā)現(xiàn)，單純低氧組不能顯著促進(jìn)大鼠心肌組織血管的生成，但是有許多CD34染色不是很深，成絲狀的血管樣結(jié)構(gòu)，還沒(méi)有形成功能性的血管。這與某些學(xué)者的研究結(jié)果不相一致，國(guó)內(nèi)有學(xué)者觀察大鼠在模擬5 000 m高原低氧5 d、15 d和30 d后，心肌****、血供和心功能變化。發(fā)現(xiàn)：急性低氧5 d時(shí)，心肌****未新生，心肌血流量顯著增加；隨低氧時(shí)間的推移，15 d以后，****增生。鄭瀾等在低氧訓(xùn)練促進(jìn)心肌組織微血管體視學(xué)研究中表明，僅經(jīng)低氧處理不能增加大鼠心肌組織微血管密度，低氧中****密度的增加是因?yàn)榧±w維橫斷面減少，而不是由于血管新生。Olfert等研究發(fā)現(xiàn)長(zhǎng)期低氧未能增加****/肌纖維比,****數(shù)量也無(wú)增加。產(chǎn)生這些矛盾結(jié)果的原因可能與受試對(duì)象、低氧程度、低氧時(shí)間及低氧時(shí)的其它環(huán)境等因素有關(guān)。

研究發(fā)現(xiàn)短期的低氧可誘導(dǎo)大鼠心肌VEGF表達(dá)升高,從而促進(jìn)****的生成反應(yīng)，如延長(zhǎng)低氧時(shí)間,VEGF表達(dá)將受到抑制，降低血管生成反應(yīng)的發(fā)生。這是因?yàn)闄C(jī)體內(nèi)由缺氧引發(fā)VEGF發(fā)生的這一系統(tǒng)存在負(fù)反饋調(diào)節(jié)機(jī)制。隨著低氧時(shí)間的延長(zhǎng)，出現(xiàn)了機(jī)體對(duì)缺氧的習(xí)服，反復(fù)的缺氧使VEGF對(duì)缺氧不敏感，逐步恢復(fù)到基礎(chǔ)水平,****不再發(fā)生增生。本文研究中低氧試驗(yàn)的時(shí)間長(zhǎng)達(dá)10周，使機(jī)體對(duì)缺氧產(chǎn)生了習(xí)服，因此本文的研究中****的增生不是很明顯。

3.2 運(yùn)動(dòng)與血管生成 耐力訓(xùn)練在使心肌代謝能力增長(zhǎng)的同時(shí)，產(chǎn)生血管生成反應(yīng)。本研究發(fā)現(xiàn)運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練組心肌組織CD34的蛋白表達(dá)豐富，較不運(yùn)動(dòng)組和低氧組有顯著性差別。對(duì)遞增負(fù)荷耐力訓(xùn)練的研究也表明,心肌組織血管床橫斷面積的增加主要在于小動(dòng)脈數(shù)量和大血管的管徑的增加。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn),增加的原因是由于在****生成的同時(shí),有一部分****通過(guò)“動(dòng)脈化”途徑轉(zhuǎn)變成動(dòng)脈,從而掩蓋了****的新生這一現(xiàn)象。Tagarakis等的研究認(rèn)為,運(yùn)動(dòng)可使心肌****密度顯著增加。大量文獻(xiàn)也表明,****在運(yùn)動(dòng)中發(fā)生了生理性或病理性重塑:適宜的運(yùn)動(dòng)負(fù)荷導(dǎo)致心肌組織中****數(shù)量增多。Leon和Bloor用HE染色用墨汁灌注的方法先后研究了幼年，成年和老年大鼠經(jīng)游泳訓(xùn)練后心肌毛細(xì)血及****與心肌纖維比值(C:F),得出結(jié)果:C:F各年齡組增多，提示****增多。較多的研究報(bào)道:正常動(dòng)物在運(yùn)動(dòng)條件下VEGFmRNA顯著升高,這種條件并不產(chǎn)生明顯低氧,說(shuō)明肌肉收縮時(shí)還要其它信號(hào)能提高VEGFmRNA。這些信號(hào)可由運(yùn)動(dòng)中關(guān)系血流量的刺激源和/或肌肉運(yùn)動(dòng)時(shí)負(fù)荷導(dǎo)致的機(jī)械變化而引起。例如:運(yùn)動(dòng)時(shí)剪切力的增加可以提高NO水平，而適量的NO可激活VEGF的表達(dá)，促進(jìn)血管新生。機(jī)械刺激還可擾亂基底膜中與肝素結(jié)合的bFGF,促進(jìn)VEGF的表達(dá)。隨著訓(xùn)練時(shí)間的延長(zhǎng)VEGF對(duì)運(yùn)動(dòng)的反應(yīng)削弱，運(yùn)動(dòng)誘導(dǎo)的VEGF水平升高可對(duì)訓(xùn)練產(chǎn)生適應(yīng)。

因?yàn)楸驹囼?yàn)常氧訓(xùn)練的方案每個(gè)星期采用的都是遞增負(fù)荷，使運(yùn)動(dòng)保持對(duì)VEGF的持續(xù)刺激，誘導(dǎo)大量的VEGF表達(dá)，促進(jìn)血管的新生。因此本試驗(yàn)結(jié)果顯示運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練組有血管新生。

3.3 低氧訓(xùn)練與血管生成 低氧訓(xùn)練使人體承受環(huán)境缺氧和負(fù)荷缺氧的雙重刺激,因此有著比單一訓(xùn)練刺激更高水平的適應(yīng)。本研究發(fā)現(xiàn)，在低氧訓(xùn)練狀態(tài)下大鼠心肌組織有大量的新生血管生成。這與很多學(xué)者的研究結(jié)果相吻合：鄭瀾的研究結(jié)果表明低氧運(yùn)動(dòng)可使心肌組織以芽生的方式或者非芽生的方式形成新的****，而通過(guò)透射電鏡可觀察到是以非芽生的血管生成方式為主。陳福刁等研究經(jīng)過(guò)4周的每天12 h的海拔4 000 m慢性間歇低氧訓(xùn)練的大鼠，其心肌****產(chǎn)生適應(yīng)性改變。毛杉杉等觀察到急性低氧力竭運(yùn)動(dòng)可引起心肌****新生，但屬于速發(fā)效應(yīng)。黃麗英等發(fā)現(xiàn)每天12 h的海拔4 000 m慢性間歇低氧訓(xùn)練能顯著增加心肌組織的微血管。另外研究表明,適度的間歇低氧適應(yīng)結(jié)合運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練可更好地促進(jìn)心肌VEGFmRNA的表達(dá),促進(jìn)心肌血管再生。

同常氧訓(xùn)練一樣,隨著心肌對(duì)低氧運(yùn)動(dòng)的適應(yīng),VEGFmRNA水平對(duì)低氧訓(xùn)練的升高反應(yīng)減弱。這是因?yàn)榻M織局部缺氧形成的氧梯度,是VEGF表達(dá)升高的先決條件。一旦這種氧梯度不存在或消失,VEGF就不會(huì)表達(dá)或是表達(dá)上調(diào)的VEGF開(kāi)始下降［19］，從而使血管生成反應(yīng)消失。因本試驗(yàn)低氧訓(xùn)練的方案每個(gè)星期采用的都是遞增負(fù)荷，使機(jī)體在前一個(gè)星期產(chǎn)生的習(xí)服，在下一個(gè)星期很快就在新的負(fù)荷刺激作用下產(chǎn)生不習(xí)服，始終使機(jī)體的局部缺氧組織產(chǎn)生氧梯度，因此試驗(yàn)結(jié)果表明低氧訓(xùn)練組有著豐富的血管新生。

盡管各低氧訓(xùn)練組能顯著促進(jìn)心肌組織的血管新生，但是各低氧組對(duì)心肌組織血管新生的影響程度還是略有不同。從各低氧訓(xùn)練組相互比較來(lái)看，高住高練低練在血管生成的效果方面優(yōu)于其他的低氧訓(xùn)練組，而高住低練和低住高練對(duì)血管新生的影響差別不大。這可能是高住低練訓(xùn)練法雖然有利于訓(xùn)練強(qiáng)度和量的提高，但是，卻分散了低氧與訓(xùn)練的雙重刺激強(qiáng)度。低住高練訓(xùn)練法雖然通過(guò)缺氧和訓(xùn)練的雙重負(fù)荷對(duì)機(jī)體造成刺激，但由于缺氧暴露時(shí)間短，對(duì)缺氧刺激時(shí)間不足,對(duì)機(jī)體的刺激強(qiáng)度也不大。而高住高練低練，既讓運(yùn)動(dòng)員居住低氧環(huán)境中，又同時(shí)在低氧環(huán)境中進(jìn)行運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練，加大了低氧與訓(xùn)練對(duì)機(jī)體的刺激強(qiáng)度，使機(jī)體各個(gè)系統(tǒng)產(chǎn)生更深刻的代償性適應(yīng)，從而使血管生成的效果更顯著。研究結(jié)果表明高住低練組與低住高練組相比，微血管密度增加不明顯，但微血管染色的程度加深。高住高練低練組與高住低練組、低住高練組相比，微血管增加明顯（P<0.05），血管開(kāi)始形成較清晰的圓形。

從以上的分析討論中我們可以得知，低氧訓(xùn)練能很好地促進(jìn)心肌組織****的新生，尤其是高住高練低練訓(xùn)練法，血管生成很豐富。因此采用遞增負(fù)荷跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練及低氧作為處理因素,建立起來(lái)的這種低氧加訓(xùn)練的低氧訓(xùn)練動(dòng)物模型,能很好地促進(jìn)心肌組織的血管新生,能為血管的生理性重建提供一個(gè)新的研究方法和途徑。