1 材料與方法
1.1 動物分組 健康純系雄性SD大鼠72只（8周齡），隨機分成對照組（CON）、4周實驗組（4周）、3周實驗組（3周）、2周實驗組（2周）、1周實驗組（1周）和3 d實驗組（3 d），每組12只，各組體重?zé)o顯著性差異。分籠飼養(yǎng)，適應(yīng)2 d后分別處置。飼養(yǎng)環(huán)境溫度為（22±2）℃，相對濕度為45%～55%，自然光照，自由飲食、飲水。實驗動物分組見表1。
1.2 大鼠靜力性運動實驗臺的設(shè)計 設(shè)計自制空心實驗臺，臺上安裝可調(diào)節(jié)高度的鐵架。鐵架橫梁表面有用以固定大鼠前肢的光滑凹槽。在鐵架下方臺面鉆3個圓孔，2孔在前，相距3 cm，其連線距鐵架橫梁投影線后5 cm并與之平行，用于施加負(fù)荷的砝碼通過而懸掛在大鼠踝關(guān)節(jié)上，同時起到固定大鼠后肢保持靜力性運動的作用；另1個孔在前面2孔連線中點后2 cm處，用于實驗中容納鼠尾，避免鼠尾支撐。 　　1.3 大鼠靜力性運動方式 實驗時將大鼠前肢固定在鐵架橫梁上，調(diào)節(jié)高度使其兩側(cè)后肢踝關(guān)節(jié)處于跖屈位支撐站立（以跖趾關(guān)節(jié)大支撐不離開臺面為標(biāo)準(zhǔn)），并在兩側(cè)踝關(guān)節(jié)處各施加50%體重的負(fù)荷（圖1）。此種施加負(fù)荷方式可以雙側(cè)腓腸肌的肌纖維處于靜力性收縮的募集模式。每天上、下午各訓(xùn)練1 h，分別訓(xùn)練3 d、1周、2周、3周和4周。大鼠均在全部訓(xùn)練結(jié)束次日宰殺取材。對照組不訓(xùn)練，其它條件與實驗組相同。運動訓(xùn)練安排詳見表2。
1.4 取材和標(biāo)本制備
圖1 實驗大鼠的運動方式
1.4.1 取材 稱取體重，眼底取血，斷頭處死?？焖偃∽蠛笾枘c肌內(nèi)側(cè)頭中下部1/3處約0.5 cm×0.5 cm×1 cm肌組織，入4%中性多聚甲醛固定。在每組中隨機取3只動物左后肢腓腸肌同一位置約0.5 cm×0.5 cm×0.1 cm組織塊，立即入3%戊二醛固定。制備血清，-80℃保存待測。
1.4.2 石蠟切片制備及HE染色 將4%中性多聚甲醛固定的肌組織塊經(jīng)脫水、透明后，石蠟包埋，橫向和縱向連續(xù)切片，厚度為5 μm。常規(guī)HE染色。
1.4.3 電鏡切片制備及染色 將3%戊二醛中固定的肌組織塊入0.18 mmol/L蔗糖緩沖液浸泡后沖洗，1%鋨酸固定，梯度丙酮脫水，浸酯后包埋。連續(xù)超薄切片，厚度為500～800 A°。醋酸雙氧鈾和檸檬酸鉛雙重染色。
1.5 測試指標(biāo)與方法
1.5.1 腓腸肌常規(guī)組織學(xué)觀察 將HE切片置于OLYMPUSBX51型光學(xué)顯微鏡下，以10×40放大倍數(shù)取視野四角和中央共5個區(qū)域觀察。
1.5.2 腓腸肌透射電鏡觀察 將電鏡標(biāo)本置于JEM-100CX Ⅱ型電子顯微鏡下，以7 200～36 000倍對視野的四角和中央共5個區(qū)域進行觀察、拍照。
1.5.3 血清肌酸激酶（CK）和乳酸脫氫酶（LDH）活性的測定 采用南京建成生物工程研究所提供的試劑盒，嚴(yán)格按說明書進行操作。
1.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計處理 數(shù)據(jù)均以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（Mean±SD）表示，使用SPSS10.0統(tǒng)計軟件進行處理，采用單因素方差分析進行各組間的差異顯著性檢驗。顯著性水平為P﹤0.05。
2 實驗結(jié)果
2.1 大鼠體重的變化 由表3所示，施加靜力性負(fù)荷期間各實驗組體重均顯著低于對照組同時期體重（P<0.01），而且隨著時間的延長，這種趨勢更加顯著。4周組大鼠的體重在第1周內(nèi)沒有增加（P>0.01），其余時間也呈緩慢增加趨勢；3周組體重在第1周出現(xiàn)負(fù)增長（P<0.05），其余時間增長也極為緩慢；而2周組、1周組和3 d組體重在施加負(fù)荷期內(nèi)均持續(xù)負(fù)增長，且施加負(fù)荷結(jié)束時體重均顯著低于開始時（P<0.01）。
2.2 大鼠一般狀態(tài)的變化 大鼠在施加負(fù)荷前均神態(tài)安靜，對食物的反應(yīng)較敏感，受到捕捉時有明顯的逃避反應(yīng)。施加負(fù)荷時，大鼠明顯煩躁不安，訓(xùn)練后逃避反應(yīng)明顯下降，有些基本無逃避反應(yīng)，而且后肢肌肉觸感明顯較硬，不愿站立，需匍匐3～5 min才可行走。在施加負(fù)荷至第1周后，普遍出現(xiàn)反應(yīng)遲鈍、萎靡不振等現(xiàn)象。
2.3 腓腸肌常規(guī)組織學(xué)的變化 對照組的骨骼肌表現(xiàn)為肌膜清晰，肌纖維明暗條紋規(guī)則整齊，未見變性、壞死（圖2）。
3 d組可見與肌束膜連接處肌纖維細(xì)胞核增多，明顯的小片狀肌纖維溶解、壞死，肌膜模糊、不連續(xù)，大量**細(xì)胞浸潤，間質(zhì)成纖維母細(xì)胞增生（圖3）。
1周和2周組表現(xiàn)相似，與肌束膜連接處肌纖維細(xì)胞核增多，肌纖維變性，肌膜模糊、不完整，但**細(xì)胞浸潤和成纖維母細(xì)胞增生明顯減少（圖4、圖5）。
3周組可見多灶性肌纖維變性，局部肌纖維橫紋模糊，肌膜不完整，**細(xì)胞浸潤和成纖維母細(xì)胞增生較1周和2周實驗組增多（圖6）。
4周組多見肌纖維變性，**細(xì)胞浸潤和成纖維母細(xì)胞增生較明顯，局部肌纖維正常結(jié)構(gòu)喪失，肌膜模糊（圖7）。
2.4 腓腸肌超微結(jié)構(gòu)的變化
對照組的骨骼肌肌原纖維排列規(guī)則，A、I帶及Z線清晰整齊（圖7）。
3 d組與1周組骨骼肌超微結(jié)構(gòu)的變化主要是Z線出現(xiàn)異常，具體表現(xiàn)為鋸齒狀、斜坡狀（Z線流），局部Z線扭曲、斷裂，偶見肌絲扭曲、肌節(jié)錯位現(xiàn)象。2周、3周和4周組除上述異常現(xiàn)象外，還較常見肌絲排列紊亂、扭曲，肌節(jié)結(jié)構(gòu)模糊，無法區(qū)分A帶、I帶，甚至肌節(jié)斷裂、消失等現(xiàn)象。以上各種超微結(jié)構(gòu)的典型變化見附圖8～12。
2.5 血清肌酸激酶活性的變化 由表4可見，各實驗組大鼠血清肌酸激酶（CK）活性較對照組均顯著升高（P<0.01）。不同時間實驗組間的變化趨勢表現(xiàn)為3 d～1周時持續(xù)上升，1周～4周逐漸回落，其中第4周時與第1周相比有顯著性差異（P<0.05），其余各實驗組間均無顯著性差異。
2.6 血清乳酸脫氫酶活性的變化 由表4可見，各實驗組大鼠血清乳酸脫氫酶（LDH）活性與對照組相比均顯著升高（P<0.01）。不同實驗組間的變化趨勢表現(xiàn)為3 d時已達到一個峰值，1～3周明顯回落，與3 d組相比均有顯著性差異（P<0.05或 P<0.01），至第4周時又明顯升高，且與第1周和第2周時有顯著性差異（P<0.05）。
3 討 論
3.1 施加不同時間靜力性負(fù)荷對大鼠體重的影響 體重的下降常提示存在身體機能狀態(tài)下降和對外界刺激因素的不適應(yīng)[7]。本研究中各實驗組大鼠的體重在施加靜力性負(fù)荷前后的變化說明，在3 d～4周后肢負(fù)重站立的靜力性訓(xùn)練中，大鼠始終處于對施加負(fù)荷和運動方式的不適應(yīng)或勉強適應(yīng)狀態(tài)。大量研究表明，肌肉運動性損傷的直接誘因是肌肉受到不習(xí)慣或不適應(yīng)的負(fù)荷所致[8]。因此，本研究的運動負(fù)荷和運動方式對建立骨骼肌靜力性負(fù)荷所致?lián)p傷動物模型是適合的。
3.2 施加不同時間靜力性負(fù)荷對大鼠腓腸肌微觀結(jié)構(gòu)的影響 肌肉在進行靜力性收縮時與離心性和向心性收縮有不同的特征，此時肌肉不發(fā)生長度變化，但肌張力持續(xù)作用的時間較長，肌內(nèi)壓持續(xù)保持較高狀態(tài)，使肌肉血供和代謝產(chǎn)物排出產(chǎn)生障礙。由此提示，肌肉靜力性運動后微觀結(jié)構(gòu)的變化可能與離心性和向心性收縮方式所致變化有所不同。另外在實際工作和運動訓(xùn)練中，由于肌肉不適或酸痛而停止工作或訓(xùn)練的現(xiàn)象較少見，因此研究連續(xù)施加靜力性負(fù)荷對骨骼肌的影響比研究施加一次性靜力性負(fù)荷更具實際意義。 　　本研究的結(jié)果表明，施加3 d～4周靜力性負(fù)荷均使骨骼肌微觀結(jié)構(gòu)發(fā)生了改變，而且3周和4周時**細(xì)胞浸潤和成纖維母細(xì)胞增生較1周和2周時更明顯， 2～4周時超微結(jié)構(gòu)改變較3 d～1周時更嚴(yán)重。由于本實驗對大鼠后肢施加的是一種相對恒定的負(fù)荷，甚至在體重出現(xiàn)負(fù)增長時負(fù)荷還有所降低，因此表明連續(xù)施加相同強度和負(fù)荷量的靜力性負(fù)荷可以產(chǎn)生對骨骼肌微觀結(jié)構(gòu)的累積性損害。
許多學(xué)者認(rèn)為運動性肌肉微損傷結(jié)構(gòu)的變化不具有累積性損害作用。Nosaka和Byrnes等均發(fā)現(xiàn)重復(fù)性離心訓(xùn)練并不影響次訓(xùn)練后延遲性肌肉酸痛的恢復(fù)[9，10]。馬建等[11]對家兔進行4 d或7 d離心疲勞訓(xùn)練后發(fā)現(xiàn)，4 d時脛前肌纖維的變性、吞噬、間質(zhì)水腫和炎細(xì)胞浸潤程度均非常明顯，7 d時明顯減少或消失。分析以往研究與本研究結(jié)果存在差異的原因，我們認(rèn)為運動性肌肉微損傷結(jié)構(gòu)的變化是否具有累積性損害作用，并不僅僅決定于強度和負(fù)荷量，還與運動方式有關(guān)。勞動生理學(xué)的調(diào)查證明[12]，靜態(tài)負(fù)荷較動態(tài)負(fù)荷更容易引起肌肉的疲勞和損傷。本研究中大鼠一般狀態(tài)的表現(xiàn)和體重的變化趨勢，表明長時間、連續(xù)的靜力性運動是機體不易適應(yīng)的運動方式，因此導(dǎo)致骨骼肌微觀結(jié)構(gòu)的損傷和程度的累積。這可能與肌肉工作特征和代謝方式有關(guān)。由此提示機體長期、重復(fù)的處于某種強迫體位或進行維持某種固定姿勢的靜力性運動，可能是導(dǎo)致肌肉慢性損傷的潛在性因素。
另外，有研究認(rèn)為機械牽拉是離心性收縮所致肌肉損傷的始動因素，其中肌張力起主要作用[13，14]。本實驗中常規(guī)組織學(xué)的觀察可見與肌束膜連接處肌纖維細(xì)胞核增多，肌纖維變性在與肌束膜連接處也較常見，提示在骨骼肌長時間靜力性運動中，肌張力的持續(xù)作用可能是造成肌纖維損傷的重要因素。
3.3 施加不同時間靜力性負(fù)荷對大鼠血清肌肉酶活性的影響 正常生理狀況下血液中CK、LDH等肌肉酶的含量甚微。在運動過程中，由于肌膜易于受到損傷，導(dǎo)致通透性增加，使其進入血液，從而引起血中肌肉酶活性增高[13，14]。因此，它們在運動后含量的變化可以間接反映肌細(xì)胞的損傷。本研究觀察了施加不同時間靜力性負(fù)荷后大鼠血清CK和LDH活性的變化，希望從另一角度來檢驗?zāi)Ｐ偷慕⑹欠癯晒Α?br> 本研究的結(jié)果表明，施加不同時間靜力性負(fù)荷后，大鼠血清CK和LDH活性與對照組相比均顯著升高，血清CK 3 d～1周時持續(xù)上升，1周后逐漸回落，至第4周時仍顯著高于對照組。血清LDH活性的變化趨勢與CK略有不同，具有雙相特征，表現(xiàn)為3 d時已達到一個峰值，1～3周明顯回落，至第4周時又明顯升高，且與第1周和第2周時有顯著性差異。
這表明施加靜力性負(fù)荷導(dǎo)致骨骼肌細(xì)胞膜損傷，其屏障作用減弱，通透性增加。這與以往多數(shù)研究結(jié)果一致[14，15]，且與本研究中組織學(xué)結(jié)構(gòu)出現(xiàn)肌膜模糊、不連續(xù)的變化相符合，故從另一角度說明本模型的靜力性負(fù)荷造成了骨骼肌損傷。
然而，也有學(xué)者對用血清肌肉酶活性來評價肌肉損傷的作用提出了質(zhì)疑。Van Der Meulen[16]和Manfredi[17]均報道肌酸激酶的升高與活檢標(biāo)本肌內(nèi)是否損傷沒有聯(lián)系。上述研究的不同結(jié)果可能與采用的肌肉標(biāo)本不同有關(guān)。由于肌肉損傷**于肌肉內(nèi)的局部[18]，因此肌肉活檢時若未檢到這樣小范圍的損傷就可能造成研究結(jié)果的不同。
本研究中血清CK和LDH活性的變化與骨骼肌微觀結(jié)構(gòu)損傷的現(xiàn)象基本相符，但時相并不一致。這可能與骨骼肌并不是血清中肌肉酶的來源有關(guān)。殷勁等[19]發(fā)現(xiàn)，家免在劇烈運動致疲勞后，血清中LDH的兩種同工酶LDHl及LDH5均升高，但來自骨骼肌的LDH5的活性低于心肌釋放的LDHl，很顯然該運動對心肌和骨骼肌均產(chǎn)生了影響。一般認(rèn)為，運動對機體的影響是多組織的而不是單一的，血清中CK、LDH在運動后的增加是多組織釋放的總效應(yīng)，因此造成它們活性的變化與骨骼肌微觀結(jié)構(gòu)損傷的時相不一致。據(jù)此本研究認(rèn)為血清CK和LDH可以作為反映靜力性負(fù)荷所致肌肉損傷的間接指標(biāo)。
綜上所述，本研究采用的持續(xù)3 d～4周的大鼠后肢負(fù)重站立的靜力性負(fù)荷導(dǎo)致骨骼肌發(fā)生了損傷，說明模型的建立是成功的。與以往模型相比，本模型在肌纖維募集方式、肌肉工作性質(zhì)與自然生理狀態(tài)的符合、較少的附加影響因素以及運動的可重復(fù)性等方面具有明顯的優(yōu)勢，因此更適合進行骨骼肌靜力性負(fù)荷所致?lián)p傷的發(fā)生、修復(fù)與再生機制的研究。
4 結(jié) 論
1）持續(xù)3 d～4周的大鼠后肢負(fù)重站立的靜力性負(fù)荷可誘發(fā)骨骼肌發(fā)生損傷，可用于骨骼肌靜力性負(fù)荷所致?lián)p傷的研究模型，此模型在肌纖維募集方式、肌肉工作性質(zhì)與自然生理狀態(tài)的符合、較少的附加影響因素以及運動的可重復(fù)性等方面具有明顯的優(yōu)勢。
2）同等強度和負(fù)荷量的連續(xù)的靜力性負(fù)荷可以產(chǎn)生對骨骼肌微觀結(jié)構(gòu)的累積性損害。
3）血清CK和LDH可以作為反映靜力性負(fù)荷所致肌肉損傷的間接指標(biāo)。