一、SDS-PAGE電泳過(guò)程

問(wèn)題1. SDS-PAGE電泳過(guò)程中凝膠漏液或凝膠面不平

應(yīng)對(duì)措施：

1）玻璃板洗刷干凈

2）加入的AP和TEMED的量要準(zhǔn)確

3）凝膠混合液配好后要充分混勻

4）控制電壓或采取措施（冰上，冰箱）凝膠溫度一致

5）玻璃板底部對(duì)齊

6）架子要夾緊，防止漏膠造成膠面不平

問(wèn)題2. 條帶比正常的窄？條帶向上彎或向下彎？

應(yīng)對(duì)措施：

1）凝膠聚合不均勻，灌膠時(shí)盡量混合均勻，動(dòng)作輕緩

2）拔梳子要迅速，清洗加樣孔要小心，以免把上樣帶扭曲

3）樣品鹽濃度過(guò)高會(huì)擠壓其他條帶導(dǎo)致寬窄不一，純化樣品，調(diào)整鹽濃度

4）膠板底部有氣泡會(huì)影響電泳效果，應(yīng)趕走氣泡。同時(shí)注意電泳槽裝置是否合適

5）每個(gè)加樣孔體積應(yīng)一致，防止由于體積不同導(dǎo)致不同孔之間的擠壓

二、轉(zhuǎn)膜及抗體檢測(cè)過(guò)程

問(wèn)題1. 凝膠腫脹或卷曲？

應(yīng)對(duì)措施：可將凝膠在轉(zhuǎn)膜之前放到轉(zhuǎn)膜緩沖液中浸泡5-10min

問(wèn)題2. 條帶歪斜或漂移？

應(yīng)對(duì)措施：電轉(zhuǎn)儀長(zhǎng)期使用導(dǎo)致海綿變薄，“三明治”結(jié)構(gòu)不緊湊導(dǎo)致?？稍趦蓧K海綿之間墊上少許普通的草紙

問(wèn)題3. 單個(gè)或多個(gè)白點(diǎn)？

應(yīng)對(duì)措施：膜和膠塊之間沒(méi)有氣泡

問(wèn)題4. 轉(zhuǎn)膜緩沖液過(guò)熱？

應(yīng)對(duì)措施：緩沖液中離子濃度太低，電流或電壓太高。轉(zhuǎn)膜過(guò)程注意降溫

三、轉(zhuǎn)移到膜上的蛋白很少

原因1. 蛋白分子量<10KD

應(yīng)對(duì)措施：蛋白分子量<10KD時(shí)，減少轉(zhuǎn)膜時(shí)間，使用小孔徑的膜

原因2. 蛋白分子量過(guò)大

應(yīng)對(duì)措施：增加轉(zhuǎn)膜時(shí)間，過(guò)程中注意保持低溫

原因3. 蛋白的等電點(diǎn)<9

應(yīng)對(duì)措施：更換高PH值Buffer

原因4. SDS濃度不合適

應(yīng)對(duì)措施：轉(zhuǎn)移緩沖液加入終濃度0.1% SDS，也是為了增加轉(zhuǎn)移效率

原因5. 凝膠太厚

應(yīng)對(duì)措施：延長(zhǎng)轉(zhuǎn)膜時(shí)間，過(guò)程中注意保持低溫

原因6. 轉(zhuǎn)膜效率低

應(yīng)對(duì)措施：

1）轉(zhuǎn)移緩沖液中加入20%甲醇（終濃度），因?yàn)榧状伎山档偷鞍踪|(zhì)洗脫效率，但可增加蛋白質(zhì)和膜的結(jié)合能力，甲醇可以防止凝膠變形，甲醇對(duì)高分子量蛋白質(zhì)可延長(zhǎng)轉(zhuǎn)移時(shí)間

2）用上等的轉(zhuǎn)移膜