重癥肌無力(myasthenia gravis，MG)是一種神經(jīng)肌肉接頭傳遞障礙的獲得性自身免疫性疾病。病變主要是累及神經(jīng)-接頭突出后膜上乙酰膽堿受體(acetylcholine receptor，AchR)。臨床主要表現(xiàn)為受累骨骼肌肉極易疲勞，經(jīng)休息和服用抗膽堿酯酶藥后可部分恢復(fù)為特征。乙酰膽堿受體抗體(AChR antibody， AChRab)的增加是MG發(fā)病機(jī)制中的主要因素，但是其致病機(jī)理和**方法尚有待于進(jìn)一步完善，因此研究實(shí)驗(yàn)性動(dòng)物模型的制備具有重要意義。

當(dāng)人們意識(shí)到AChRAb是MG發(fā)病關(guān)鍵所在之后，1973年Pat rick等從電鰻電器官提取純化AChR ，免疫接種新西蘭大白兔后獲得實(shí)驗(yàn)性自身免疫性重癥肌無力(experimental autoimmune myasthenia gravis ， EAMG)模型，后來在大鼠、小鼠、豚鼠、猴用同樣方法也制備了EAMG模型。隨著蛋白質(zhì)組織化學(xué)的發(fā)展，現(xiàn)已掌握了人及一些實(shí)驗(yàn)動(dòng)物AChR主要致病區(qū)的肽鏈結(jié)構(gòu)，因此出現(xiàn)了用合成多肽作為免疫原制備EAMG模型的方法。

1 模型制備方法

1.1以AchR蛋白為免疫原建立動(dòng)物模型從丁(氏)雙鰭電鰩的電器官分離乙酰膽堿受體(AchR)免疫大鼠，建立實(shí)驗(yàn)性重癥肌無力(EAMG)動(dòng)物模型。方法：參照徐浩鵬等方法從丁(氏)雙鰭電鰩的電器官提取AchR蛋白，并采用Folin酚試劑法及酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)檢測(cè)提取蛋白的含量及活性；以提取的蛋白主動(dòng)免疫Lewis大鼠，健康、雌性8周齡Lewis大鼠24只隨機(jī)分為3組，即正常對(duì)照組、福(氏)佐劑(CFA)對(duì)照組、AchR+CFA實(shí)驗(yàn)組，每組8只。實(shí)驗(yàn)組大鼠分別于足墊、腹部及背部皮下多點(diǎn)注射乳劑1.5mL，第4周再次注射上述乳劑免疫大鼠。CFA對(duì)照組只接受等量CFA皮下注射。

1.2用MG患者血清中的AchR抗體建立動(dòng)物模型重癥肌無力被動(dòng)轉(zhuǎn)移小鼠模型(P-EAMG)的制作，血清陰性(SNMG)和血清陽性(SPMG)組小鼠每日分別腹腔注射SNMG或SPMG患者血清0.6mL，連續(xù)7天。對(duì)照組小鼠注射方法同P-EAMG組。所有小鼠定義詞注射血清后24h腹腔注射環(huán)磷酰胺(300mg/kg)，以抑制小鼠對(duì)人血清蛋白的免疫反應(yīng)。還有用胸腺移植建立重癥肌無力動(dòng)物模型，Schonbeck等將MG患者的胸腺組織移植到嚴(yán)重免疫缺陷小鼠腎被膜下1～2周后，在小鼠血清中可檢測(cè)到抗人AchRAb，11周時(shí)抗人AchRAb滴度增至重度MG水平，且在骨骼肌運(yùn)動(dòng)終板處可見Ig沉積。說明MG患者的胸腺組織能誘導(dǎo)和維持自身抗體產(chǎn)生。MG患者切除胸腺后細(xì)胞免疫、體液免疫均受抑制，AchRAb減少，糾正了MG免疫調(diào)節(jié)紊亂，故70%的患者癥狀緩解或改善。

1.3采用乙酰膽堿受體單克隆抗體體建立動(dòng)物模型采用乙酰膽堿受體(nAchR)單克隆抗體mAb35建立C57BL /6幼年小鼠重癥肌無力被動(dòng)轉(zhuǎn)移模型。健康清潔級(jí)，雌性C57BL /6小鼠48只， 4～5周齡，體重12～14 g參照文獻(xiàn)將實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分為實(shí)驗(yàn)組(E)和對(duì)照組(N)，實(shí)驗(yàn)組分為3組(E1、E2、E3) 每組12只。分別經(jīng)腹腔注射含0.5、1.0、1.5mg/kg mAb35的Ringer’s液0.2mL給B6幼年小鼠，對(duì)照組(N)注射不含mAb35的Ringer’s液0.2mL。

1.4基因疫苗免疫小鼠建立重癥肌無力動(dòng)物模型郝志波等，用基因疫苗pcDNA2AchR-α211免疫C57BL/6小鼠建立實(shí)驗(yàn)性自身免疫性重癥肌無力模型(EAMG)。方法：將人乙酰膽堿受體α亞基N端的主要免疫區(qū)(AChRα211)的基因片段插入到穿梭載體pcDNA3.0中，構(gòu)建基因疫苗pcDNA2AChR-α211。大量提純質(zhì)粒pcDNA2AChR-α211后肌肉注射C57BL/6小鼠。用ELISA法檢測(cè)小鼠血清中抗AChR-α211的IgG(AChRAb)，并用PCR方法檢測(cè)外源基因在小鼠各組織器官中的分布情況。

此外，用鼠源乙酰膽堿受體α亞基97-116肽段(R97-116)復(fù)制EAMG模型；吳懷國(guó)等乙酰膽堿受體α亞基125-147肽段制作實(shí)驗(yàn)性重癥肌無力動(dòng)物模型的研究。

2觀察指標(biāo)

2.1臨床觀察按Lennon等[15]的分級(jí)法將癥狀嚴(yán)重程度分為4級(jí)。0級(jí)：沒有的無力表現(xiàn)；1級(jí)：撕咬無力，四肢力量較差，在光滑地面上前肢打滑，活動(dòng)減少且易疲勞；2級(jí)：明顯無力，休息時(shí)身體呈隆起姿勢(shì)，頭尾下垂，大腿外展，前肢趾彎曲，動(dòng)作笨拙，行走不穩(wěn)；3級(jí)：嚴(yán)重?zé)o力表現(xiàn)，無撕咬動(dòng)作，肌肉震顫，呼吸困難，瀕死或死亡。

2.2AChR數(shù)目的計(jì)算將正常小鼠和EAMG小鼠后肢肌肉溶于1%(體積分?jǐn)?shù))TritonX-100中，分別加入過量125I標(biāo)記過的α-銀環(huán)蛇毒(α2But x)的磷酸鹽緩沖液，孵育1～3h后加入過量兔抗鼠IgG進(jìn)行免疫沉淀反應(yīng)，所得沉淀物用磷酸鹽緩沖液沖洗2遍后用γ-計(jì)數(shù)儀計(jì)數(shù)，并用標(biāo)準(zhǔn)曲線求取已結(jié)合抗體的AchR數(shù)。EAMG模型的AChR數(shù)目應(yīng)較正常鼠明顯減少。

2.3肌電圖動(dòng)物麻醉后固定于解剖板上，將成對(duì)刺激電極以2～3mm距離插至坐骨切跡附近肌肉內(nèi)，記錄電極置于腓腸肌內(nèi)側(cè)頭(跟腱附著處)。重復(fù)用50～100Hz電刺激時(shí)EAMG模型的腓腸肌電位及收縮波幅呈衰減反應(yīng)。

2.4光鏡觀察實(shí)驗(yàn)動(dòng)物斷頸處死，迅速取其腓腸肌，以40g/L多聚甲醛固定，常規(guī)制作石蠟切片。然后用011moL/Lα2Butx標(biāo)記辣根過氧化酶(α2Butx2HRP)孵育切片1h，用PBS洗3次，后用聯(lián)苯二胺雙氧水(DAB2H2O2)于室溫下顯色，在光學(xué)顯微鏡下觀察運(yùn)動(dòng)終板上AChR數(shù)目的改變。光鏡下可見EAMG動(dòng)物神經(jīng)末梢和肌纖維處有巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)，部分肌細(xì)胞呈節(jié)段性壞死，運(yùn)動(dòng)終板上AchR數(shù)目減少。

2.5電鏡觀察實(shí)驗(yàn)小鼠斷頸處死，迅速取其腓腸肌，用高碘酸鹽2賴氨酸2多聚甲醛(PL P)液固定2h，沿肌纖維走行切成0.15cm×0.15cm×1.1cm大小塊，用PBS沖洗，放至0.1moL/Lα2 Butx2HRP中，于4℃孵育2h ，用PBS洗凈，以DAB2H2O2顯色。用立體顯微鏡觀察，選擇NMJ多的部位行25g/L戊二醛及鋨酸固定，脫水，環(huán)氧類樹脂(Epon812)包埋，制成6μm切片，經(jīng)醋酸鈾和枸櫞酸鉛雙重染色后，用EM100/CR電鏡觀察。電鏡下顯示EAMG動(dòng)物突觸后區(qū)域簡(jiǎn)單化，突觸后膜皺褶退化，突觸間隙加寬。通過TJ TY-400 TC圖像分析儀測(cè)量神經(jīng)末梢面積、突觸前后膜長(zhǎng)度及其比值、突觸后膜面積。EAMG動(dòng)物顯示平均突觸后膜面積減小，突觸后膜長(zhǎng)度變短，突觸后膜與前膜長(zhǎng)度比值變小。