SDS-Page電泳主要利用聚丙烯酰胺的分子篩效應(yīng)分離蛋白質(zhì)和核酸，SDS-PAG蛋白質(zhì)電泳分析可從蛋白質(zhì)亞基分子量的大小就分離蛋白質(zhì)。

1、連續(xù)系統(tǒng)：電泳體系中緩沖液pH值及凝膠濃度相同，帶電顆粒在電場作用下，主要靠電荷和分子篩效應(yīng)。

2、不連續(xù)系統(tǒng)：緩沖液離子成分、pH、凝膠濃度及電位梯度均不連續(xù)性，帶電顆粒在電場中泳動不僅有電荷效應(yīng)，分子篩效應(yīng)，還具有濃縮效應(yīng)，因而其分離條帶清晰度及分辨率均較前者佳。

1、試劑配制（注意：所用試劑均需分析純）

1）5mol/L三羥甲基氨基甲烷-鹽酸，Tris-HCl，pH: 8.8：稱取181.71g三羥甲基氨基甲烷加適量超純水溶解，用鹽酸調(diào)pH值至8.8，加超純水定容至1000ml。

2）29.2%丙烯酰胺-0.8% N,N’-甲叉雙丙烯酰胺：稱取29.2g丙烯酰胺，0.8g N, N’-甲叉雙丙烯酰胺，加超純水溶解，并定容至100ml，混勻后用濾紙過濾，避光保存。

注意：丙烯酰胺為劇毒試劑，易被皮膚吸收，使用過程中勿必要戴橡膠手套。

3）10%十二烷基硫酸鈉（SDS）：稱取1g十二烷基硫酸鈉，加超純水溶解，并定容至10ml，室溫保存。

4）四甲基乙二胺原液（TEMED）

5）10%過硫酸銨：稱取1g過硫酸銨，加10ml超純水溶解。

6）1mol/L三羥甲基氨基甲烷-鹽酸，pH: 6.8：稱取12.114g三羥甲基氨基甲烷（Tris-Base）加適量純化水溶解，用鹽酸調(diào)pH值至6.8，加超純水定容至100ml。

7）10倍電極緩沖液貯液：稱取甘氨酸288.26g，三羥甲基氨基甲烷60.57g，十二烷基硫酸鈉20g，加超純水定容至2L。

8）非還原型2×樣品緩沖液：稱取三羥甲基氨基甲烷3.03g，溴酚藍(lán)0.02g，十二烷基硫酸鈉8g，鹽酸1.89ml，甘油40ml，加超純水溶解并定容至200ml，混勻，分裝小管，2~8℃儲存。

9） 還原型2×樣品緩沖液：稱取三羥甲基氨基甲烷3.03g，溴酚藍(lán)0.02g，十二烷基硫酸鈉8g，鹽酸1.89ml，甘油40ml，加超純水溶解并定容至200ml，再加入β-巰基乙醇40ml，混勻，分裝小管，2~8℃儲存。

10）考馬斯亮藍(lán)染色液：450ml乙醇，450ml純化水，混勻，加入稱好的2.5g考馬斯亮藍(lán)R-250及100ml冰醋酸，放磁力攪拌器上攪拌至少8小時，過濾即得。

11）考馬斯亮藍(lán)脫色液：450ml乙醇，450純化水，混勻，再加100ml冰醋酸，混勻即得。

12）分子量標(biāo)準(zhǔn)蛋白：凍干粉產(chǎn)品按說明書溶解稀釋后，經(jīng)100℃水浴，放冷后分裝于小管中，-20℃保存；液體產(chǎn)品則直接分裝于小管中，-20℃保存，標(biāo)簽上注明使用前需水浴，有效期6個月。

2、實驗外包助手樣品處理

取量待檢樣品按蛋白含量用超純水稀釋至1mg/ml，取稀釋好的樣品與5X樣品緩沖液(20ul+5ul)在一個eppendorf 管中混合。分子量標(biāo)準(zhǔn)蛋白的處理方法按標(biāo)簽說明，如需水浴則同樣品一起100℃加熱5-10min，取上清點樣，

如不需水浴則直接上樣。

3、凝膠配置

制備分離膠：將配好的分離膠灌入電泳槽中，加水覆蓋，室溫下聚合。（室溫不同，聚合時間不同）

凝膠配方如下（兩塊膠）：

制備濃縮膠

待分離膠聚合后，用濾紙吸去上面的水層，再灌入濃縮膠（配方見上表），插入樣品梳，注意避免氣泡出現(xiàn)。

4、SDS-PAGE電泳

調(diào)膠：拔掉SDS膠上的梳子，并用小針調(diào)整齒的位置（使它們都平行）。

點樣：用20μL的小槍頭，吸煮過的樣品10μL，對準(zhǔn)膠孔點樣，注意不要把樣品點在外面。使用適當(dāng)?shù)姆肿恿康鞍譵arker。

電泳：電泳儀正負(fù)極接好，打開電源。濃縮膠：電壓 low 100V

分離膠：電壓 high 150V。

卸膠：等膠內(nèi)的所有的藍(lán)色都跑出去，電泳停止，一般時間為1-2小時左右。把膠板從電泳儀上卸下，用刀片把膠板撬開，膠的濃縮膠部分割除；

染色：放入考馬斯亮藍(lán)R-250染色液中進(jìn)行常溫過夜染色；

脫色：將過夜染色的SDS-PAGE膠放入脫色液中進(jìn)行脫色，直到背景發(fā)白。

5、數(shù)據(jù)處理：

掃描：將干燥的凝膠放入掃描儀，掃描后計算純度。

純度計算：按峰面積歸一法計算目標(biāo)蛋白的純度。

分子量的計算：以分子量標(biāo)準(zhǔn)蛋白的對數(shù)分子量與其遷移率作標(biāo)準(zhǔn)曲線，代入樣品遷移率計算該樣品的分子量。